Niha†Navnîşana niha: OX11 0DE, Keyaniya Yekbûyî, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Keyaniya Yekbûyî, Diamond Light Source Co., Ltd., Navenda Wênekirina Biyolojîk a Elektronîkî.
Kompleksa berhevkirina ronahiyê ya navenda reaksiyonê 1 (RC-LH1) pêkhateya fotosentezê ya bingehîn a bakteriyên fototrofîk ên binefşî ye. Me du avahiyên mîkroskopiya krîo-elektronî yên kompleksa RC-LH1 ji Rhodopseudomonas palustris dan nasîn. Avahiya çareseriya 2.65-Å ya kompleksa RC-LH114-W ji 14 lûpên LH1 yên binebeş pêk tê ku RC dorpêç dikin, ku ji hêla proteîna W ve tê qut kirin, lê kompleksa bê proteîn-W bi tevahî pêkhateya RC ye ku ji hêla RC ve hatiye dorpêç kirin. 16 lûpa LH1 ya binebeş girtî. Berawirdkirina van avahiyan têgihîştinê li ser dînamîkên kînonê di kompleksa RC-LH1 de peyda dike, di nav de guhertinên konformasyonê yên berê nehatine destnîşankirin dema ku kînon li cîhê RC QB ve girêdayî ye, û her weha cîhê cihên girêdana kînonê yên alîkar, ku alîkariya Derbaskirina wan bo RC dikin. Avahiya bêhempa ya proteîna W pêşî li girtina lûpa LH1 digire, bi vî rengî kanalek ji bo lezandina danûstandina kînon/kînolon diafirîne.
Enerjiya ku ji hêla fotosentezê ve tê peyda kirin dikare hema hema hemî jiyanê li ser erdê bidomîne, û ji bo biyoteknolojiya rojê potansiyelek mezin heye. Dema ku fotosenteza gerdûnî pêşve dixin, bakteriyên fototrofîk ên binefşî di heman demê de modên enerjiyê û şiyanên metabolîk ên cûrbecûr nîşan didin. Ew dikarin ji fotosentezê dûr bisekinin û wekî bakteriyên heterotrofîk di tariyê de mezin bibin, dikarin nîtrojen û karbondîoksîtê rast bikin, hîdrojenê hilberînin, û pêkhateyên aromatîk hilweşînin (1-3). Ji bo ku ji bo van pêvajoyan enerjiyê peyda bikin, divê ronahî bi lez û bez û bi bandor veguhere enerjiya kîmyewî. Ev pêvajo dest pê dike dema ku kompleksa antenna ku ronahiyê digire ronahiyê dikişîne û enerjiya girtî vediguhezîne navenda reaksiyonê (RC), bi vî rengî veqetandina bargiraniyê dest pê dike (4-7). Yekîneya bingehîn a fotosentezê di bakteriyên fototrofîk ên binefşî de ji RC-ya celeb 2 pêk tê, ku ji hêla kompleksa berhevkirina ronahiyê 1 (LH1) ve dorpêçkirî ye, kompleksa bingehîn a RC-LH1 pêk tîne. LH1 ji hêla rêzek heterodîmerên αβ yên qurmiçî ve tê çêkirin, ku her yek ji wan du molekulên klorofîl (BChl) a bakterî û yek an du karotenoîdan (8-12) girêdide. Antena LH1 ya herî hêsan ji 16 an 17 αβ heterodîmer pêk tê ku RC (9-13) di xelekek girtî de dorpêç dikin, lê di kompleksên din ên bingehîn de, peptîdên transmembranî berdewamiya LH1 ya derdorê qut dikin, bi vî rengî belavbûna kînol/kînon di navbera RC û kompleksa sîtokrom bc1 de pêş dixin (11, 13-15). Nebata binefşî ya fototrofîk Rhodopseudomonas (Rps.) organîzmayek model e ku dikare veguheztina enerjî û elektronê ku piştgirîya fotosentezê dike fam bike. Avahiya krîstal a yekem a Rps. Modela kompleksa palustris RC-LH1 RC ye, ku bi 15 xelekên LH1 yên heterodîmerîk dorpêçkirî ye, ku ji hêla proteînek nenas a bi navê "Proteîn W" ve têne qut kirin (14). Proteîn-W paşê wekî RPA4402 hate nas kirin, ku proteînek 10.5kDa ya nenaskirî ye ku sê helîksên transmembranî yên pêşbînîkirî (TMH) hene (16). Em pêşniyar dikin ku gena rpa4402 ku proteîna W kod dike, ji nû ve were guhertin, da ku bi navdêra ku ji bo genên ku RC-L, M (pufL, pufM) û LH1α, β (pufA, pufB) kod dikin re lihevhatî be. Bi balkêşî, proteîna-W tenê di nêzîkî 10% ji RC-LH1 de heye, ku eşkere dike ku Rps. palustris du kompleksên RC-LH1 yên cûda çêdike. Li vir, em avahiyên krîo-EM (kryo-EM) yên çareseriya bilind ên du kompleksên bingehîn radigihînin, yek bi proteîna W û 14 αβ heterodîmer, ya din bêyî proteîna W û xelekek LH1 ya 16 Heterodîmer a girtî radigihînin. Avahiya me guherînek gavek di têgihîştina kompleksa RC-LH1 ya Rps. palustris de temsîl dike, ji ber ku me nifûsa homojen a her varyantê analîz kiriye û çareseriyek têr heye ku em bi zelalî her peptîd û pigmentên girêdayî û lîpîd û kînonan destnîşan bikin. Berawirdkirina van avahiyan nîşan dide ku sê proteînên TMH-W ku heta niha di tu kompleksa din a RC-LH1 de nehatine dîtin, kanalek kînon çêdikin da ku danûstandina kînon/kînolon bilezînin. Hejmarek ji cihên girêdana lîpîd û kînon ên parastî hatine destnîşankirin, û me piştî tevlihevkirina kînon û RC guherînek nû ya konformasyonê eşkere kiriye, ku dibe ku ji bo RC ya fotosîstema II (PSII) ya organîzmayên fototrofîk ên oksîjenkirî guncan be. Dîtina me têgihiştinên nû li ser kînetîka girêdana kînon/kînolon û danûstandinê di kompleksa bingehîn a RC-LH1 ya bakteriyên fototrofîk ên binefşî de peyda dike.
Ji bo hêsankirina lêkolîneke berfireh a du kompleksên ku di Rps. palustris de têne dîtin, me her RC-LH1 bi rêbazên biyokîmyayî veqetandin. Kompleksa kêmasiya proteîna W (ku ji vir û pê ve wekî ΔpufW tê binavkirin) ji şaneya ku gena pufW tune ye hate paqijkirin (16), û tenê yek kompleksa RC-LH1 dikare were hilberandin. Kompleksa ku proteîna W dihewîne ji hêla şaneyek ve tê hilberandin. Proteîna W ya vê şaneyê bi etîketek 10x His li dawiya C-ya xwe tê guhertin, da ku kompleksa ku proteîna W dihewîne bi bandor bi piraniya proteîna W ya ku tune ye bi rêya bêmobîlkirina metalê were hev kirin. Kompleks bi bandor tê veqetandin (16) Kromatografiya Afînê (IMAC).
Wekî ku di Şekil 1 de tê xuyang kirin, her du kompleks ji sê yekeyên RC (RC-L, RC-M û RC-H) pêk tên ku bi antenek LH1 dorpêçkirî ne. Avahiya 2.80-A ya kompleksa ku proteîn-W tune ye 16 αβ heterodîmer nîşan dide, ku xeleka LH1 ya girtî çêdike ku bi tevahî RC dorpêç dike, ku ji vir û pê ve wekî kompleksa RC-LH116 tê binavkirin. Avahiya 2.65 Å ya kompleksa ku proteîn-W dihewîne, LH1 ya 14-heterodîmer heye ku ji hêla proteîn-W ve tê qut kirin, ku ji vir û pê ve wekî RC-LH114-W tê binavkirin.
(A û B) Nûneratiya rûyê pêkhateyê. (C û D) Pigmentên girêdayî yên ku di çîpan de têne îfade kirin. (E û F) Kompleksên ku ji rûyê sîtoplazmayî têne dîtin, peptîd û jêr-yekîneyên LH1 di karîkaturan de têne temsîl kirin, û ji valahiya proteîn-W li gorî demjimêrê têne hejmartin [lihevhatî bi hejmarkirina Rba. kompleksa sphaeroides (13)]. Ji bo LH1-α, rengê jêr-yekîneya proteînê zer e; ji bo LH1-β, rengê jêr-yekîneya proteînê şîn e; ji bo proteîn-W, proteîn sor e; ji bo RC-H, ew şîn e; ji bo RC-L, ew porteqalî ye; ji bo RC-M, magenta. Kofaktor bi çîpan têne temsîl kirin, kesk molekulên BChl û BPha temsîl dike, binefşî karotenoîdan temsîl dike, û zer molekulên UQ10 temsîl dike. (G û H) Dîtina mezinkirî ya valahiya proteîn-W di herêma wekhev a kompleksa RC-LH114-W (G) û kompleksa RC-LH116 (H) de. Kofaktor bi şêweya tijîkirina valahiyê têne nîşandan, kînona kelkirî bi şîn tê nîşandan. Valahiya proteîn-W bi xêzek şîn a xalxalî di (G) de tê ronîkirin, û qulên piçûk ên ku kînon/kînolol li ser xeleka LH116 belav dibe bi xêzek reş a xalxalî di (H) de têne ronîkirin.
Wêne 1 (A û B) RC nîşan dide ku bi rêzên vekirî an girtî yên heterodîmerên LH1αβ dorpêçkirî ye, ku her yek ji wan du BChl û yek karotenoidê girêdide (Wêne 1, C û D). Lêkolînên berê nîşan dane ku Rps kompleksa LH1 e. Di rêça biyosentezê ya ksantîna spirulina de, ev cure nifûsên tevlihev ên karotenoidan dihewînin (17). Lêbelê, spiropyrroxanthin karotenoîda serdest e û dendika wê têrker e. Ji ber vê yekê, me hilbijart ku spiroxanthin li hemî cihên girêdana LH1 model bikin. Polîpeptîdên alfa û beta TMH-yên yekane ne ku herêmên derveyî yên membrana kurt hene (Wêne 1, A, B, E, û F). Her çend dendika 17 bermayiyan li C-termînusê nehat dîtin jî, polîpeptîda alfa di her du kompleksan de ji Met1 ber bi Ala46 ve hate qut kirin. Polîpeptîda β ji Gly4 di RC-LH116 de ji Tyr52, û di RC-LH114-W de ji Ser5 ber bi Tyr52 ve hate kêm kirin. Tu dendika 3 an 4 bermayiyên N-termînal an 13 C-termînal nehat dîtin (Wêneya S1). Analîza spektrometriya girseyî ya kompleksa RC-LH1 ya tevlihev a ji cureya kovî hatî amadekirin nîşan da ku herêma wenda encama perçebûna heterolog a van peptîdan bû (Wêneya S1 û S2). Formîlasyona N-termînal a α-Met1 jî hate dîtin (f). Analîzê nîşan da ku α-peptîd ji bermayiyên fMet1 heta Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 pêk tê, û β-peptîd ji bermayiyên Ser2 heta Ala53 pêk tê, ku bi nexşeya dendika EM ya germahiya nizm re lihevhatinek baş heye.
Hevrêzkirina α-His29 û β-His36 BChl-an dike ku rû bi rû bimînin; her heterodîmer αβ bi cîranên xwe re dicive da ku li dora rêza rengdêrên bi eksîton ve girêdayî RC xelekek vekirî (RC-LH114-W) an xelekek girtî (RC-LH116) çêbike (Wêne 1, C û D). Li gorî benda 877 nm ya RC-LH114-W, guheztina sor a vegirtinê ya 880 nm ya RC-LH116 3 nm e (Wêne 2A). Lêbelê, spektruma dîkroîzma dorhêl hema hema yek e (Wêne 2B), ku nîşan dide ku her çend cûdahiyek eşkere di navbera xelekên vekirî û girtî de hebe jî, jîngeha herêmî ya BChl-an pir dişibihe hev. Guhertina sor a vegirtinê dibe ku encama tevgera germî ya kêmkirî û zêdebûna aramiyê li ser xelekek girtî be (18, 19), guheztina di girêdana rengdêran de ku ji hêla xelekek girtî ve hatî çêkirin (20, 21), an jî tevlîheviyek van her du bandoran be (11).
(A) Spektrumên vegirtina ultraviyole/xuya/nêzîkî-infrared, lûtkeyên wan bi pigmentên xwe yên têkildar hatine nîşankirin û li gorî lûtkeya BPh li 775 nm hatine normalîzekirin. (B) Spektrumên dîkroîzma dorhêl li gorî vegirtina BChl li 805 nm hatine normalîzekirin. (C û D) Spektrumên ΔA yên bijartî ji spektrumên vegirtina demkî yên kompleksa RC-LH114-W (C) û kompleksa RC-LH116 (D). Ji bo berawirdkirinek çêtir, hemî spektrum li gorî ΔA ya −A li 0.2 ps têne normalîzekirin. (E) Rêjeya oksîdasyona sîtokrom c2 piştî tîrêjkirinê di hebûna konsantrasyonên cûda yên UQ2 de (ji bo daneyên xav li Wêneya S8 binêre). (F) Di hucreyên ku di bin ronahiya kêm, navîn an jî bi şîddeta bilind de mezin dibin (bi rêzê ve 10, 30 an 300μMm-2 s-1), yekîneyên proteîn W û RC-L di kompleksa paqijkirî de û rêjeya membrana veqetandî. Asta proteînê bi elektroforeza jela SDS-polyacrylamide û îmmunoassay diyar bikin (ji bo daneyên xav li Wêneya S9 binêre). Rêjeya nisbî ya kompleksa RC-LH114-W ya safîkirî diyar bikin. Rêjeya stoikyometrîk a RC-L bi proteîna-W ya kompleksê re 1:1 e.
BChl-ên li pozîsyona 1-ê di xeleka deformekirî ya αβ14 ya RC-LH114-W de (Wêne 1, A, C, û E) ji BChl-ên hevseng ên di RC-LH116 de bi 6.8 Å nêzîktirê donorê sereke yê RC (P) ne (Wêne 1, B, D, û F, û Wêne S3); lêbelê, kînetîka vegirtina demkî ya her du kompleksan nîşan dide ku ji bo RC-LH114-W û RC-LH116, sabîtên dema veguhastina enerjiya teşwîqê ji LH1 berbi RC 40 ±4 û 44 ±3 ps ne (Wêne 2). , C û D, Wêne S4 û Tabloya S2). Di veguhastina elektronîkî de di nav RC de jî ferqek girîng tune (Wêne S5 û nivîsa pêvek a têkildar). Em guman dikin ku hevahengiya nêzîk a dema veguhastina enerjiyê di navbera LH1 û RC-P de ji ber dûrbûn, goşe û enerjiya potansiyel a wekhev a piraniya BChl di her du xelekên LH1 de ye. Wisa xuya dike ku lêkolîna qaliba enerjiya LH1 ji bo gihîştina dûrahiya herî kêm ne ji veguhestina rasterast a enerjiyê ji deverên nebaş bo RC zûtir e. Xala LH1 ya xeleka vekirî ya di RC-LH114-W de dibe ku di bin şert û mercên germahiya nizm de ji bo analîza avahîsaziyê tevgera germî ya ne girîng jî derbas bike, û di germahiya odeyê de ji dûrahiya rengkirina βBChls li pozîsyona RC 1 dirêjtir şekildana xeleka αβ14 heye.
Kompleksa RC-LH116 ji 32 BChl û 16 karotenoîdan pêk tê, û rêzkirina wê ya giştî wekî ya ku ji Thermochromatium (Tch.) piddipudum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) û alga kesk (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) hatiye wergirtin e. Piştî rêzkirina wan, tenê cudahîyên piçûk di pozîsyonên heterodîmerên αβ de hatin dîtin, nemaze 1-5, 15, û 16 (Wêneya S6). Hebûna proteîna-W bandorek girîng li ser avahiya LH1 dike. Sê TMH-yên wê bi lûpên kurt ve girêdayî ne, ku N-termînal li aliyê lûmenê yê kompleksê û C-termînal li aliyê sîtoplazmayî ye (Wêneyên 1A û 3, A heta D). Proteîna-W bi piranî hîdrofobîk e (Wêne 3B), û TMH2 û TMH3 bi LH1αβ-14 re têkilî datînin da ku rûyek transmembranî çêbikin (Wêne 3, B û E heta G). Rûbera navber bi giranî ji bermayiyên Phe, Leu û Val di herêma transmembranî de pêk tê. Ev bermayiyên bi asîdên amînî yên hîdrofobîk û pîgmentên αβ-14 hatine kom kirin. Hin bermayiyên polar jî beşdarî têkiliyê dibin, di nav de girêdana hîdrojenê ya di navbera W-Thr68 û β-Trp42 de li ser rûyê valahiya tevlihev (Wêne 3, F û G). Li ser rûyê sîtoplazmayê, Gln34 li kêleka koma keto ya karotenoîdên αβ-14 ye. Wekî din, molekula n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) hate çareser kirin, û dûvika wê ya hîdrofobîk dirêjî rûbera di navbera proteîn-W û αβ-14 de bû, û dûvika lîpîd dibe ku di laş de be. Her wiha me dît ku herêmên çareserbûna C-termînal ên proteîna W û RCH pir nêzîk in, lê ne di çarçoveya avakirina têkiliyên taybetî de ne (Wêne 1, A û E). Lêbelê, dibe ku di asîdên amînî yên C-termînal ên çaresernekirî yên van her du proteînan de têkilî hebin, ku dibe ku mekanîzmayek ji bo wergirtina proteîna-W di dema kombûna kompleksa RC-LH114-W de peyda bike.
(A) Proteîna-W, ku bi şêweya kartonî li rûyê rûbera LH1αβ14-ê ye, zincîreke alî ya bi şiklê çîpekê (sor) heye, ku di beşek ji diyagrama potansiyela elektrostatîk de tê xuyang kirin (rûyê gewr ê şefaf bi asta kontûrê 0.13). (B) Proteîna-W bi rûyek rengîn a hîdrofobîk tê temsîl kirin. Herêmên polar û barkirî bi rengê şîn têne xuyang kirin, herêmên hîdrofobîk bi spî têne xuyang kirin, û herêmên bi hêz hîdrofobîk bi rengê porteqalî têne xuyang kirin. (C û D) Proteîna-W bi kartonî tê temsîl kirin, arasteya wê wekî ya di (A) (C) de ye, û bi 180° hatiye zivirandin (D). Li gorî pozîsyona di rêzê de, bermayiyên cihêreng şemayek rengê kevaneyê digirin, ku N-termînal şîn e û C-termînal sor e. (E) Proteîna-W di heman dîtinê de wekî di (A) de, û bermayiyên li rûyê rûbera proteîna-W:LH1 bi çîpên bi nîşanên pêvekirî têne temsîl kirin. (F) Proteîna-W di temsîla kartonî de li gorî (E) û LH1αβ14 90°, û di temsîla xêzikî de li gorî bermayiyên navrûyê hatiye zivirandin. Bermayiyên ji polîpeptîda betayê yên daliqandî hatine nîşankirin. Kofaktor wekî xêzek ku bi rengê Wêne 1 re li hev dike tê nîşandan, β-DDM-ya hilweşiyayî bi gewr tê nîşandan, û oksîjen bi sor tê nîşandan. (G) Dîtina di (F) de 180° hatiye zivirandin, bi bermayiyên berbiçav ên polîpeptîda alfa ya nîşankirî.
Proteîn-W şûna heterodîmerek αβ (ya 15emîn di Wêne 1F de) digire, bi vî awayî rê li ber girtina xelekê û tewandina sê heterodîmerên αβ yên pêşîn digire. Hat dîtin ku goşeya meyldariya herî zêde ya heterodîmera αβ-1 ya yekem li gorî normala fîlmê 25° heta 29° bû (Wêne 1, A û E), ku ji hêla meyldariya αβ-1 ya 2° heta 8° di RC A berevajîkirina tûj-LH116 de (Wêne 1, B û F) ve hatî çêkirin. Heterodîmerên duyemîn û sêyemîn bi rêzê ve li 12° heta 22° û 5° heta 10° meyldar in. Ji ber astengiya sterîk a RC, tewandina αβ-1 cotek duyemîn a αβ (ku bi αβ ya 16emîn di Wêne 1F de re têkildar e) nagire nav xwe, bi vî awayî di xeleka LH1 de valahiyek zelal çêdike (Wêne 1, A û E). Ji ber nebûna du heterodîmerên αβ, û bi windabûna çar BChl û du karotenoîdan re, yek ji karotenoîdan bi yekîneya αβ-1 ya pêçayî ve nayê girêdan, di encamê de zengilek LH114-W çêdibe ku 13 karotenoîdên Vejeteryan û 28 BChl dihewîne. Texmînên çareseriya herêmî yên her du kompleksên di herêmên αβ1 heta 7 de ji yên mayî yên xeleka LH1 kêmtir in, ku dibe ku plastîkbûna xwerû ya yekîneya LH1 ya li kêleka cihê RC QB nîşan bide (Wêne 4).
Wêneyên RC-LH114-W (A û B) û RC-LH116 (C û D) ji heman dîtina jorîn/dîtina alî (A û B) (A û C) û rûyê valahiyê yê Şekil 1. (B û D) têne nîşandan. Bişkokên rengîn li milê rastê têne nîşandan.
Tenê kompleksa sereke ya taybetmend a din bi rêjeya stoîkyometrîk a 1:14 dîmera Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX e (13). Lêbelê, proteîna W û PufX homologiyeke eşkere nînin, û bandorek girîng li ser avahiyên LH1 yên xwe dikin. PufX TMH-yeke yekane ye ku xwedan domaineke sîtoplazmayî ya N-termînal e ku bi aliyê sîtoplazmayî yê yekîneya RC-H (13) re di pozîsyonekê de ku bi Rps. palustris LH116αβ-16 re têkildar e, têkilî datîne. PufX kanalek ji bo danûstandina kînon/kînolon di navbera RC-LH1 û kompleksa sîtokrom bcl de diafirîne û di hemî kompleksa sereke ya Rba. sphaeroides de heye (13). Her çend navbeynkariya monomer-monomer di Rba de ye. Dîmera sphaeroides RC-LH1-PufX li pozîsyona girêdana proteîna W di RC-LH114-W de ye, û valahiya ku ji hêla PufX û proteîn-W ve hatî çêkirin di pozîsyonek wekhev de ye (Wêne S7A). Valahiya di RC-LH114-W de jî bi kanala kînone ya hîpotetîk (8) ya Pseudomonas rosea LH1 re hevaheng e, ku ji hêla peptîdên ku ne bi proteîna W an PufX ve girêdayî ne ve hatî çêkirin (Wêne S7B). Wekî din, kanala kînone di Blc. LH1 ya kesk a zumrûdî de ku bi derxistina yek yekîneya γ (7) hatî çêkirin di pozîsyonek wekhev de ye (Wêne S7C). Her çend ji hêla proteînên cûda ve navbeynkar be jî, xuya bûna van kanalên kînon/kînolol di pozîsyonek hevpar de di kompleksa RC-LH1 de xuya dike ku mînakek pêşveçûna konvergent e, ku nîşan dide ku valahiya ku ji hêla proteîna W ve hatî çêkirin dibe ku wekî kanalek kînone tevbigere.
Valahiya di nav xeleka LH114-W de rê dide çêbûna herêmeke perdeyî ya domdar di navbera qada navxweyî ya kompleksa RC-LH114-W û perdeya girseyî de (Wêne 1G), li şûna ku her du domainan bi rêya porê proteînê ve wekî di proteînan de bi hev ve girêbide. Kompleksa RC-LH116 dişibihe komplekseke Tch. ya girtî. ya mîna derziyê (22) (Wêne 1H). Ji ber ku belavbûna kînonê bi rêya perdeyê ji belavbûna bi rêya kanala proteîna teng zûtir e, xeleka LH114-W ya vekirî dikare rê bide zivirîna RC ya zûtir ji xeleka LH116 ya girtî, û belavbûna kînonê di nav RC de dibe ku sînordartir be. Ji bo ceribandina ka proteîna W bandorê li veguherîna kînonan bi rêya RC dike, me ceribandinek oksîdasyona sîtokromê li ser rêjeyek diyarkirî ya ubîkînon 2 (UQ2) (analojek UQ10 ya xwezayî bi dûvikek îzoprenê ya kurttir) pêk anî (Wêne 2E). Her çend hebûna kînona kelandî rê li ber diyarkirina rast a sabita Michaelis a xuya digire (RC-LH114-W û RC-LH116 bi rêzê ji bo 0.2±0.1μM û 0.5±0.2μM guncaw in), rêjeya herî zêde ya RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) ji RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) %28±5 mezintir e.
Me di destpêkê de texmîn kir ku proteîn-W di nêzîkî 10% ji kompleksa bingehîn de heye (16); li vir, rêjeyên dagirkirina hucreyên mezinbûna kêm-ronahî, navîn-ronahî, û ronahiya zêde bi rêzê ve 15±0.6%, 11±1% û 0.9±0.5% ne (Wêne 2F). Berawirdkirina hejmarî ya spektrometriya girseyî nîşan da ku zêdekirina nîşana hîstîdînê pirbûna nisbî ya proteîn-W li gorî şaneyên celebê kovî kêm nekiriye (P = 0.59), ji ber vê yekê ev ast ne berhema proteîn-W ya guhertî ne (Wêne S10). Lêbelê, ev dagirkirina kêm a proteîn-W di kompleksa RC-LH1 de dibe ku rê bide hin RC ku bi rêjeyek bileztir bizivirin, bi vî rengî danûstandina kînon/kînolon a hêdîtir di kompleksa RC-LH116 de sivik dike. Me dît ku rêjeya dagirkirina ronahiya bilind bi daneyên transkrîptomîk ên dawî re nakok e, ku nîşan dide ku îfadeya gena pufW di bin ronahiya xurt de zêde dibe (Wêne S11) (23). Cûdahiya di navbera transkrîpsiyona pufW û tevlêbûna proteîn-W di nav kompleksa RC-LH1 de tevlihev e û dibe ku rêkxistina kompleks a proteînê nîşan bide.
Di RC-LH114-W de, 6 molekulên kardiolîpîn (CDL), 7 fosfatîdîlkolîn (POPC), 1 fosfatîdîlglîserol (POPG) û 29 molekulên β-DDM têne veqetandin û di nav wê de 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG û 12 βDDM têne model kirin. RC-LH116 (Wêne 5, A û B). Di van her du avahiyan de, CDL hema hema li aliyê sîtoplazmayî yê kompleksê cih digire, lê POPC, POPG û β-DDM bi piranî li aliyê luminal cih digirin. Du molekulên lîpîd û deterjan di herêma αβ-1 heta αβ-6 ya kompleksa RC-LH114-W de hatin veqetandin (Wêne 5A), û pênc jî di herêma wekhev a RC-LH116 de hatin veqetandin (Wêne 5B). Li aliyê din ê kompleksê lîpîdên zêdetir hatin dîtin, bi piranî CDL, ku di navbera RC û αβ-7 heta αβ-13 de kom bûne (Wêne 5, A û B). Lîpîd û deterjantên din ên bi awayekî avahî çareserkirî li derveyî zengila LH1 cih digirin, û zincîrên asîl ên baş çareserkirî di navbera yekîneyên LH1 de dirêj dibin, ku bi awayekî demkî wekî β-DDM di RC-LH114-W de hatine destnîşankirin, û wekî β-DDM di RC de hatine pênasekirin. Têkeliyek ji β-DDM û POPC-LH116. Helwestên wekhev ên lîpîd û deterjantên kelasyonî di avahiya me de nîşan didin ku ew cihên girêdanê yên fîzyolojîkî yên têkildar in (Wêne S12A). Helwestên molekulên wekhev di Tch de jî xwedî hevgirtinek baş in. Gentle û Trv. Tîpa 970 RC-LH1s (Wêneya S12, B heta E) (9, 12) û bermayiyên girêdana hîdrojenê yên koma serê lîpîdê di rêza rêzê de parastinek baş nîşan dan (Wêneya S13), ku nîşan dide ku CDL-ya ku bi RC ve girêdayî ye parastî ye (24), ev cih dikarin di kompleksa RC-LH1 de parastî bin.
(A û B) Peptîdên RC-LH114-W (A) û RC-LH116 (B) bi karîkaturan têne temsîl kirin, û pîgment bi çîpan têne temsîl kirin, bi karanîna şemaya rengîn a di Wêne 1 de. Lîpîd bi sor têne nîşandan, û deterjan bi gewr têne nîşandan. UQ ya bi cihên RC QA û QB ve girêdayî zer e, lê UQ ya îzolekirî şîn e. (C û D) Dîtinên wekî (A) û (B), lîpîd nehatine derxistin. (E heta G) Dîtina mezinkirî ya Q1(E), Q2(F) û Q3(G) ji RC-LH116, bi zincîrên alî yên ku bandorê li hev dikin. Girêdanên hîdrojenê wekî xetên reş ên xalxalî têne nîşandan.
Di RC-LH116 de, hem RC QA û hem jî QB UQ, ku di pêvajoya veqetandina bar de beşdarî veguhestina elektronan dibin, di cihên girêdana xwe de têne hilweşandin. Lêbelê, di RC-LH114-W de, QB kînon nehatiye çareserkirin û dê li jêr bi berfirehî were nîqaş kirin. Ji bilî QA û QB kînon, du molekulên UQ yên kelandî (di navbera xeleka RC û LH1 de cih digirin) di avahiya RC-LH114-W de li gorî komên serên wan ên baş-çareserkirî (bi rêzê ve di Q1 û Q2 de cih digirin) têne veqetandin. cîh). Wêne 5C). Du yekîneyên îzoprenê ji Q1 re têne veqetandin, û nexşeya dendikê 10 dûvikên îzoprenê yên tevahî yên Q2 çareser dike. Di avahiya RC-LH116 de, sê molekulên UQ10 yên kelandî (Q1 heta Q3, Wêne 5D) hatin çareserkirin, û hemî molekul li seranserê dûvikê dendikek zelal hene (Wêne 5, D heta G). Di her du avahiyan de, cihên komên serê kînon ên Q1 û Q2 xwedî hevgirtinek pir baş in (Wêne S12F), û ew tenê bi RC re têkilî daynin. Q1 li deriyê valahiya W ya RC-LH114-W ye (Wêne 1G û 5, C, D û E), û Q2 li nêzîkî cihê girêdana QB ye (Wêne 5, C, D) û F). Bermayiyên parastî yên L-Trp143 û L-Trp269 pir nêzîkî Q1 û Q2 ne û têkiliyên potansiyel ên π-stacking peyda dikin (Wêne 5, E û F, û Wêne S12). L-Gln88, 3.0 Å ji oksîjena dûr a Q1, girêdanek hîdrojenê ya bihêz peyda dike (Wêne 5E); ev bermay di hemî RC de ji bilî têkiliya herî dûr parastî ye (Wêne S13). L-Ser91 di piraniya RC-yên din de bi awayekî parastî li şûna Thr tê bikaranîn (Wêne S13), 3.8 Angstrom ji oksîjena metîl a Q1 dûr e, û dibe ku girêdanên hîdrojenê yên qels peyda bike (Wêne 5E). Xuya ye ku Q3 têkiliyek taybetî tune ye, lê di herêma hîdrofobîk a di navbera yekîneya RC-M û yekîneya LH1-α 5 heta 6 de cih digire (Wêne 5, D û G). Q1, Q2 û Q3 an kînonên kelandî yên nêzîk jî di Tch. Gentle, Trv. Strain 970 û Blc de hatine çareser kirin. Avahiya îrîsê (9, 10, 12) nîşan dide ku cîhek girêdana kînona alîkar a parastî di kompleksa RC-LH1 de ye (Wêne S12G). Pênc UQ-yên hilweşiyayî yên di RC-LH116 de bi 5.8±0.7-a her kompleksê ku bi kromatografiya şilava performansa bilind (HPLC) hatî destnîşankirin re li hev dikin, lê sê UQ-yên hilweşiyayî yên di RC-LH114-W de ji 6.2±0.3 (Wêneya S14) kêmtir in. Nirxa pîvandî ya 6.2±0.3 (Wêneya S14) nîşan dide ku molekulên UQ-yên çaresernekirî di avahiyê de hene.
Polîpeptîdên L û M yên pseudo-sîmetrîk her yek pênc TMH dihewîne û heterodîmerek çêdikin ku yek dîmera BChl, du monomerên BChl, du monomerên bakteriyofaj (BPh), û yek hesinê ne-Heme û yek an du molekulên UQ10 dihewîne. Bi hebûna girêdanên hîdrojenê li ser koma ketonê ya termînal û kombûna wê ya naskirî di Rps de, karotenoîd di yekîneya M de têne bicîh kirin, ku navê wê cis-3,4-dehydroorhodopin e. Cure (25). Domaina membrana derve ya RC-H bi yek TMH ve bi membranê ve girêdayî ye. Avahiya RC ya giştî dişibihe sê yekîneya RC ya cureyên têkildar (wek Rba). sphaeroides (ID PDB: 3I4D). Makrosîklên BChl û BPh, stûna karotenoîd û hesinê ne-heme di nav rêza çareseriyê ya van avahiyan de hevûdu digirin, her weha koma serê UQ10 li cîhê QA û kînona QB li RC-LH116 (Wêne S15).
Hebûna du avahiyên RC bi rêjeyên dagirkirina cîhê QB yên cuda derfetek nû peyda dike ji bo lêkolîna guhertinên domdar ên konformasyonê yên ku bi girêdana QB kînon re hene. Di kompleksa RC-LH116 de, QB kînon di pozîsyona "nêzîkî" ya bi tevahî girêdayî de ye (26), lê veqetandina RC-LH114-W QB kînon tune. Di RC-LH114-W de QB kînon tune, ku ecêb e ji ber ku kompleks çalak e, ji kompleksa RC-LH116 bi QB kînona çareserkirî ya avahîsaziyê bêtir. Her çend her du zengilên LH1 nêzîkî şeş kînonan kelat dikin, pênc ji wan di zengila RC-LH116 ya girtî de bi avahîsaziyê çareser dibin, lê tenê sê di zengila RC-LH114-W ya vekirî de bi avahîsaziyê sînordar in. Ev zêdebûna bêserûberiya avahîsaziyê dibe ku guheztina bileztir a cîhên QB yên RC-LH114-W, kînetîka kînona bileztir di kompleksê de, û îhtîmala zêde ya derbasbûna xeleka LH1 nîşan bide. Em pêşniyar dikin ku nebûna UQ di cihê RC QB ya RC-LH114-W de dibe ku encama kompleksek tevlihevtir û çalaktir be, û cihê QB yê RC-LH114-W di cih de di zivirîna UQ de cemidî ye. Qonaxa taybetî (deriyê cihê QB hatiye girtin) şêwaza vê çalakiyê nîşan dide.
Bêyî QB, zivirîna pêvekirî ya L-Phe217 ber bi pozîsyonek ku bi girêdana UQ10 re ne lihevhatî ye, ji ber ku ew ê bibe sedema pevçûnek fezayî bi yekîneya yekem a îzoprenê ya dûvikê (Wêne 6A). Wekî din, guhertinên sereke yên konformasyonê yên eşkere eşkere ne, nemaze helîksa de (helîksa kurt di xeleka di navbera TMH D û E de) ku L-Phe217 ber bi kîsika girêdana QB ve tê veguheztin û zivirîna L-Tyr223 (Wêne 6A) Ji bo şikandina girêdana hîdrojenê bi çarçoveya M-Asp45 û girtina deriyê cîhê girêdana QB (Wêne 6B). Helîksa de li bingeha xwe dizivire, Cα ya L-Ser209 bi 0.33 Å ve tê veguheztin, dema ku L-Val221Cα bi 3.52 Å ve tê veguheztin. Di TMH D û E de, ku di her du avahiyan de li ser hev in, guhertinên berbiçav tune ne (Wêne 6A). Bi qasî ku em dizanin, ev yekem avahiya di RC-ya xwezayî de ye ku cihê QB digire. Berawirdkirinek bi avahiya tevahî (girêdayî QB) nîşan dide ku berî ku kînon were kêmkirin, guhertinek konformasyonî hewce ye da ku ew bikeve nav kînonê. L-Phe217 dizivire da ku têkiliyek π-stacking bi koma serê kînonê re çêbike, û helîks ber bi derve ve diçe, dihêle ku îskeleta L-Gly222 û zincîra alî ya L-Tyr223 toreke girêdana hîdrojenê bi avahiyek girêdana hîdrojenê ya stabîl çêbike (Wêne 6, A û C).
(A) Kartona hevgirtî ya hologramê (zincîra L, zincîra porteqalî/zincîra M, magenta) û avahiya apo (gewr), ku tê de bermayiyên sereke bi şiklê temsîlek mîna çîp têne nîşandan. UQ10 bi xêzek zer tê temsîl kirin. Xeta xalxalî girêdanên hîdrojenê yên ku di tevahiya avahiyê de çêbûne nîşan dide. (B û C) Nûnertiya rûyê apolipoprotein û tevahiya avahiya zengilê, ku oksîjena zincîra alî ya L-Phe217 bi şîn û L-Tyr223 bi sor, bi rêzê ve, ronî dike. Yekîneya L porteqalî ye; yekîneyên M û H ne rengdar in. (D û E) Malperên Apolipoprotein (D) û tevahiya (E) RC QB [bi rêzê ve bi (A) reng bikin] û Thermophilus thermophilus PSII (kesk, şîn bi kînona plastîk; ID ya PDB: 3WU2) Lihevhatin (58).
Bi awayekî nediyar, her çend çend avahiyên RC-yên kêmasiya QB-yê bêyî LH1 hene jî, guhertinên konformasyonê yên ku di vê lêkolînê de hatine dîtin berê nehatine ragihandin. Ev tê de avahiya kêmbûna QB-yê ji Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) û Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) hene, ku hemî hema hema wekî avahiya wan a giştî ya QB-yê ne. Lêkolînek ji nêz ve ya 3PRC eşkere kir ku molekulên deterjanê yên LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) li deriyê pozîsyona QB-yê girêdidin, ku dibe ku rê li ber ji nû ve rêzkirinê bigire nav konformasyonek girtî. Her çend LDAO di heman pozîsyonê de di 1EYS an 1OGV-yê de hilnaweşe jî, ev RC bi karanîna heman deterjanê têne amadekirin û ji ber vê yekê dibe ku heman bandorê çêbikin. Avahiya krîstal a Rba. Sphaeroides RC ya ku bi sîtokrom c2 re hev-krîstalîze bûye (PDB ID: 1L9B) jî xuya dike ku cîhek QB ya girtî heye. Lêbelê, di vê rewşê de, herêma N-termînal a polîpeptîda RC-M (ku bi rêya girêdana H ya bermayiya Tyr li ser helîxa Q bi cîhê girêdana QB re têkilî datîne) şekildanek neasayî digire, û guherîna şekildaniya QB bêtir nayê lêkolîn kirin (30). Tiştê dilniya dike ev e ku me ev celeb deformasyona polîpeptîda M di avahiya RC-LH114-W de nedîtiye, ku hema hema wekî herêma N-termînal a RC-LH116 RC ye. Divê her weha were zanîn ku piştî rakirina antenna LH1 ya li ser bingeha deterjanê, RC-yên apolipoproteîn di PDB de hatin çareser kirin, ku hewzên kînon ên hundurîn û lîpîdên di valahiya di navbera RC û rûyê hundurîn ê zengila LH1 ya derdorê de ji holê rakirin (31, 32). RC fonksiyonel dimîne ji ber ku ew hemî kofaktoran diparêze, ji bilî kînona QB ya hilweşîner, ku kêmtir aram e û pir caran di dema pêvajoya amadekirinê de winda dibe (33). Wekî din, tê zanîn ku rakirina LH1 û lîpîdên çerxî yên xwezayî ji RC dikare bandorê li ser fonksiyonan bike, wekî temenê kurtkirî yê rewşa P+QB ya ji hev veqetandî (31, 34, 35). Ji ber vê yekê, em texmîn dikin ku hebûna zengila LH1 ya herêmî ya li dora RC dikare cîhê QB ya "girtî" biparêze, bi vî rengî jîngeha herêmî ya nêzîkî QB biparêze.
Her çend apolipoproteîn (bêyî QB kînon) û avahiya tevahî tenê du wêneyên guhertina cihê QB temsîl dikin, ne rêzek bûyeran, nîşan hene ku girêdan dikare were girtin da ku ji nû ve girêdan ji hêla hîdrokînon ve were asteng kirin da ku astengkirina substratê were asteng kirin. Têkiliya kînolol û kînon li nêzî cihê QB ya apolipoproteînê dibe ku cûda be, ku dibe sedema redkirina wê ji hêla RC ve. Demek dirêj e ku tê pêşniyar kirin ku guhertinên konformasyonî di girêdan û kêmkirina kînonan de rolek dilîzin. Şîyana RC-yên cemidî ya kêmkirina kînonan piştî adaptasyona tariyê kêm dibe (36); krîstalografiya tîrêjên X nîşan dide ku ev zirar ji ber ku kînoyên QB di konformasyonek "distal" de bi qasî 4.5 Å ji pozîsyona proksîmal a çalak asê mane (26), 37). Em pêşniyar dikin ku ev konformasyona girêdana dûr wêneyek rewşa navîn di navbera apolipoproteîn û avahiya zengila tevahî de ye, ku piştî têkiliya destpêkê bi kînon û vekirina cihê QB tê.
RC ya tîpa II ku di kompleksa PSII ya hin bakterî û sîyanobakterî, alg û nebatan de tê dîtin, xwedî parastina avahî û fonksiyonel e (38). Hevrêziya avahîsaziyê ya ku di Wêne 6 (D û E) de tê nîşandan, dişibihiya di navbera RC-yên PSII û cihê QB yê kompleksa RC ya bakteriyan de tekez dike. Ev berawirdkirin demek dirêj e ku modelek ji bo lêkolîna pergalên girêdan û kêmkirina kînonê yên bi hev ve girêdayî ye. Weşanên berê pêşniyar kirin ku guhertinên konformasyonî bi kêmkirina kînonan a PSII re têne (39, 40). Ji ber vê yekê, bi berçavgirtina parastina evolusyonî ya RC, ev mekanîzmaya girêdanê ya ku berê nehatibû dîtin dibe ku ji bo cihê QB yê RC ya PSII di nebatan fototrofîk ên oksîjenkirî de jî were sepandin.
Rps ΔpufW (jêbirina pufW ya bê nîşankirin) û PufW-His (proteîna C-termînal 10x His-tagged proteîn-W ku ji lokusa xwezayî ya pufW tê îfadekirin). palustris CGA009 di xebata me ya berê de (16) hate vegotin. Ev şane û dêûbavê celebê kovî yê îzojenî bi xêzkirina hejmareke piçûk ji şaneyan li ser plakaya PYE (her 5 g lître -1) (di LB de di -80 °C de hatî hilanîn, ku tê de 50% (w/v) glîserol) proteîn, ekstrakta hevîrtirşkê û sûksînat heye) agar [1.5% (w/v)] ji cemidankê hatin wergirtin. Plak di germahiya odeyê de di bin şert û mercên anaerobîk de tevahiya şevê di tariyê de di bin şarjê de hat înkubasyonkirin, û dûv re bi ronahiya spî (~50 μmolm-2 s-1) ku ji hêla ampûlên halojen ên OSRAM 116-W (RS Components, UK) ve hatî peyda kirin ji bo 3 heta 5 rojan hat ronîkirin heya ku koloniyek yekane xuya bibe. Ji bo derzîkirina 10 ml ji navgîna M22+ (41) ku bi 0.1% (w/v) asîdên kazamîno (ku ji vir û pê ve wekî M22 tê binavkirin) hatiye zêdekirin, koloniyek yekane hat bikaranîn. Çand di bin şert û mercên oksîjena kêm de di tariyê de di 34°C de bi hejandina di 180 rpm de ji bo 48 saetan hat mezin kirin, û dûv re 70 ml ji çandê di heman şert û mercan de ji bo 24 saetan hat derzîkirin. Çandek nîv-aerobîk bi qebareya 1 ml tê bikaranîn da ku 30 ml ji navgîna M22 di şûşeyek cama şefaf a gerdûnî ya 30 ml de were derzîkirin û bi çîpa tevdanê ya hêza manyetîk a sterîl bi tevlihevkirinê (~50μmolm-2 s-1) ji bo 48 saetan were tîrêjkirin. Dûv re 30 ml ji çandê di bin heman şert û mercan de bi qasî 1 lître çandê hat derzîkirin, ku dûv re ji bo derzîkirina nêzîkî 9 lître çanda ku bi ~200 μmolm-2 s-1 ronîkirî bû ji bo 72 saetan hat bikaranîn. Hucre bi rêya santrifujkirinê li 7132 RCF bo 30 xulekan hatin berhevkirin, di nav ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) de ji nû ve hatin rawestan, û heta ku pêwîst be di -20°C de hatin hilanîn.
Piştî helandinê, hinek krîstalên deoksîrîbonukleaz I (Merck, Keyaniya Yekbûyî), lîzozîm (Merck, Keyaniya Yekbûyî) û du tabletên astengkerê proteaza holoenzîmê yên Roche (Merck, Keyaniya Yekbûyî) li şaneyên ji nû ve hatine daliqandin zêde bikin. Di şaneyek zextê ya Fransî ya 20,000 psi (Aminco, DYA), şane 8 heta 12 caran hatin parçekirin. Piştî rakirina şaneyên neşikestî û bermayiyên neçareser bi santrifujkirinê li 18,500 RCF ji bo 15 hûrdeman li 4°C, membran ji lîzata pigmentkirî bi santrifujkirinê li 113,000 RCF ji bo 2 saetan li 43,000°C hate danîn. Fraksiyona çareserker bavêjin û membrana rengîn di 100 heta 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) de ji nû ve daliqînin û homojen bikin heta ku kombûnên xuya nebin. Membrana daliqandî di tariyê de li 4°C bi tevdana nerm, saetekê di nav 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) de ku ji %2 (w/v) β-DDM pêk dihat, hat înkubasyonkirin. Piştre, li 70°C santrifujkirin da ku 150,000 RCF li 4°C ji bo saetekê bihele da ku madeyên neçareser ên mayî werin rakirin.
Membrana çareserker ji şaneya ΔpufW li ser stûneke danûstandina îyonê ya DEAE Sepharose ya 50 ml bi sê cildên stûnê (CV) ji tampona girêdanê [20 mM tris-HCl (pH 8.0) ku 0.03% (w / v) β-DDM tê de heye] hate sepandin. Stûnê bi du tamponên girêdana CV bişon, û dûv re stûnê bi du tamponên girêdanê yên ku 50 mM NaCl tê de hene bişon. Kompleksa RC-LH116 bi gradyaneke xêzikî ya 150 heta 300 mM NaCl (di tampona girêdanê de) li ser 1.75 CV hate elutekirin, û kompleksa girêdanê ya mayî bi tamponeke girêdanê ya ku 300 mM NaCl tê de heye li ser 0.5 CV hate elutekirin. Spektûreya vegirtinê di navbera 250 û 1000 nm de berhev bike, fraksiyona bi rêjeya vegirtinê (A880/A280) ji 1 mezintir li 880 heta 280 nm bihêle, du caran di tampona girêdanê de têkel bike, û dîsa heman prosedur li ser stûna DEAE bikar bîne. Dema paqijkirinê, fraksiyonên bi rêjeyên A880/A280 ji 1.7 bilindtir û rêjeyên A880/A805 ji 3.0 bilindtir têkel bike, gera sêyemîn a danûstandina îyonê pêk bîne, û fraksiyonên bi rêjeyên A880/A280 ji 2.2 bilindtir û rêjeyên A880/A805 ji 5.0 bilindtir bihêle. Kompleksa qismî paqijkirî di fîltera santrifuj a Amicon 100,000 giraniya molekulî (MWCO) (Merck, UK) de heta nêzîkî 2 ml hate komkirin, û li ser stûnek derxistina mezinahiya Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) ku tampona NaCl 200 mM tê de heye hate barkirin, û dûv re di heman tamponê de bi 1.5 CV hate elutekirin. Spektorên vegirtinê yên fraksiyona derxistina mezinahiyê berhev bikin, û spektrumên vegirtinê bi rêjeyên A880/A280 li ser 2.4 û rêjeyên A880/A805 li ser 5.8 heta 100 A880 kom bikin, û tavilê wan ji bo amadekirina tora cryo-TEM an hilanînê bikar bînin. Heta ku pêwîst be li -80°C bihêlin.
Membrana çareserker ji şaneya PufW-His li ser stûneke HisPrep FF Ni-NTA Sepharose ya 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ku 200 mM NaCl û 0.03% (w/w) tê de heye) di tampona IMAC (GE Healthcare) de hate sepandin. v) β-DDM]. Stûn bi pênc CV tampona IMAC, û dûv re bi pênc CV tampona IMAC ku 10 mM hîstîdîn tê de heye hate şuştin. Kompleksa bingehîn bi pênc tamponên IMAC ku 100 mM hîstîdîn tê de hene ji stûnê hate derxistin. Fraksiyona ku kompleksa RC-LH114-W tê de heye di tankek tevlihevkirî de ku bi fîlterek Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK) ve hatî çêkirin, heya ~10 ml tê konsantrekirin, 20 caran bi tampona girêdanê tê şilkirin, û dûv re li 25 ml tê zêdekirin. Di stûna DEAE Sepharose de, çar CV yên ku bi tamponê ve girêdayî ne pêşwext têne bikar anîn. Stûnê bi çar tamponên girêdana CV bişo, paşê kompleks li ser heşt CV-yan li ser gradienteke xêzikî ya 0 heta 100 mM NaCl (di tampona girêdanê de) elute bike, û çar CV-yên mayî tampona girêdanê 100 mM dihewîne. Kompleksên mayî yên li ser klorîda sodyûmê elute kirin ku bi rêjeya A880/A280 ya ji 2.4 bilindtir û rêjeya A880/A805 ya ji 4.6 bilindtir re hatine tevlihev kirin, di fîltera navendî ya Amicon 100,000 MWCO de heta ~2 ml hatin konsantre kirin, û bi stûna derxistina mezinahiya Superdex 200 16/600 ya pêşwext a 1.5 CV hatin dagirtin, û dûv re di heman tamponê de li ser 1.5 CV hatin elute kirin. Spektorên vegirtinê yên fraksiyonên nelihevhatina mezinahî berhev bikin û spektrumên vegirtinê bi rêjeyên A880/A280 li ser 2.1 û rêjeyên A880/A805 li ser 4.6 heta 100 A880 kom bikin, ku tavilê ji bo amadekirina tora TEM ya cemidî têne bikar anîn an jî heya ku hewce be di -80°C de têne hilanîn.
Ji bo amadekirina torên TEM ên germahiya nizm, sarincokeke Leica EM GP hat bikaranîn. Kompleks di tampona IMAC de heta A880 ya 50 hat şilkirin, û dû re 5μl li ser toreke sifir a QUANTIFOIL 1.2/1.3 a bi karbon pêçayî ya nû bi şewqê derketî (Agar Scientific, UK) hat barkirin. Torê di 20°C û şilbûna nisbî ya %60 de ji bo 30 saniyan înkubasyon bikin, dû re ji bo 3 saniyan hişk bikin, û dû re di etana şil de di -176°C de bihelînin.
Daneyên kompleksa RC-LH114-W li ser eBIC (Navenda Biyoîmajîkirina Elektronîkî) (Çavkaniya Ronahiya Dîamondê ya Brîtanî) bi mîkroskopa Titan Krios, ku bi voltaja lezkirinê ya 300kV, bi mezinkirina nominal a 130,000× û enerjiyek ji - valahiyek 20 eV hilbijêrin, hatin tomar kirin. Quantumek Gatan 968 GIF bi detektora lûtkeya K2 ji bo tomar kirina wêneyan di moda jimartinê de ji bo berhevkirina daneyan hat bikar anîn. Mezinahiya pîkselê ya kalibrkirî 1.048 Å ye, û rêjeya dozê 3.83 e-Å-2s-1 e. Fîlm di 11 saniyan de hat berhev kirin û li 40 beşan hat dabeş kirin. Qada bi karbonê pêçayî bikar bînin da ku mîkroskopê ji nû ve fokus bikin, û dûv re sê fîlm ji her qulikê berhev bikin. Bi tevahî, 3130 fîlm hatin berhev kirin, bi nirxên defokusê di navbera -1 û -3μm de.
Daneyên ji bo kompleksa RC-LH116 bi karanîna heman mîkroskopê li Asterbury Biostructure Laboratory (Zanîngeha Leeds, Keyaniya Yekbûyî) hatin berhevkirin. Daneyên di moda hejmartinê de bi mezinkirina 130 k hatin berhevkirin, û mezinahiya pîkselê bi dozek 4.6 e-Å-2s-1 ji bo 1.065 Å hat kalibrkirin. Fîlm di 12 saniyan de hat tomarkirin û li 48 beşan hat dabeşkirin. Bi tevahî, 3359 fîlm hatin berhevkirin, bi nirxên defokusê di navbera -1 û -3μm de.
Hemû pêvajoya daneyan di lûleya Relion 3.0 (42) de tê kirin. Ji bo rastkirina tevgera tîrêjê bi giraniya dozê, Motioncorr 2 (43) bikar bînin, û dûv re CTFFIND 4.1 (44) bikar bînin da ku parametreya CTF (fonksiyona veguhastina berevajî) diyar bikin. Fotomîkrografên tîpîk piştî van qonaxên pêvajoya destpêkê di Wêne 2. S16 de têne nîşandan. Şablona hilbijartina otomatîk bi hilbijartina destan a nêzîkî 250 pîkselên 1000 perçeyan di çarçoveyek 250 pîkselî de û bê dabeşkirina referansê ya du-alî (2D) tê çêkirin, bi vî rengî wan dabeşkirinên ku lihevhatina nimûneyê dikin an jî taybetmendiyên wan ên diyar tune ne red dikin. Dûv re, hilbijartina otomatîk li ser hemî mîkrofotografan hate kirin, û RC-LH114-W 849,359 perçe bû, û kompleksa RC-LH116 476,547 perçe bû. Hemû perçeyên bijartî du dewre ji dabeşkirina 2D ya ne-referansê derbas bûne, û piştî her ceribandinê, perçeyên ku li gorî qada karbonê, qirêjbûna nimûneyê, bê taybetmendiyên eşkere an perçeyên ku bi tundî li hev dikevin têne redkirin, ku di encamê de bi rêzê ve 772,033 (90.9%) û 359,678 (75.5%) perçe ji bo dabeşkirina 3D ya RC-LH114-W û RC-LH116 têne bikar anîn. Modela referansa 3D ya destpêkê bi karanîna rêbaza daketina gradient a stokastîk hate çêkirin. Bi karanîna modela destpêkê wekî referans, perçeyên bijartî di 3D de di çar kategoriyan de têne dabeş kirin. Bi karanîna modela di vê kategoriyê de wekî referans, rafinerkirina 3D li ser perçeyên di kategoriya herî mezin de pêk bînin, dûv re fîltera derbasbûna nizm a 15 Å ya destpêkê bikar bînin da ku qada çareserkerê veşêrin, 6 pîkselên qiraxên nerm lê zêde bikin, û pîkselan piştî pêvajoyê bikin da ku fonksiyona veguhastina Modulasyona lûtkeya Gatan K2 ya detektora jorîn rast bikin. Ji bo daneya RC-LH114-W, ev modela destpêkê bi rakirina dendika bihêz li qiraxên maskeyê (ku ji dendika kompleksa bingehîn a di UCSF Chimera de qut bûye) hate guhertin. Modelên encam (çareseriyên RC-LH114-W û RC-LH116 bi rêzê ve 3.91 û 4.16 Å ne) wekî referans ji bo gera duyemîn a dabeşkirina 3D têne bikar anîn. Perçeyên ku têne bikar anîn di çîna destpêkê ya 3D de têne kom kirin û têkiliyek xurt bi cîrantiyê re nagirin. Hevbeşbûn an nebûna taybetmendiyên avahîsaziyê yên eşkere. Piştî gera duyemîn a dabeşkirina 3D, kategoriya bi çareseriya herî bilind hate hilbijartin [Ji bo RC-LH114-W, yek kategori 377,703 perçe (44.5%) e, ji bo RC-LH116, du kategori hene, bi tevahî 260,752 perçe (54.7%), ku ew tenê dema ku piştî zivirîna destpêkê bi cûdahiyek piçûk têne hevrêz kirin yek in]. Perçeyên bijartî di qutiyek 400-pîkselî de ji nû ve têne derxistin û bi rafinerkirina 3D têne rafinekirin. Maska çareserker bi karanîna fîltera destpêkê ya derbasbûna nizm a 15Å, berfirehkirina nexşeya 3 pîkselî û maskeya nerm a 3 pîkselî tê çêkirin. Bi karanîna rafinerkirina CTF ya serê-perçeyî, rastkirina tevgera serê-perçeyî û gera duyemîn a rafinerkirina CTF ya serê-perçeyî, rafinerkirina 3D, maskekirina çareserker û pêvajoya piştî-pêvajoyê piştî her gavê têne kirin da ku tekstûra encam bêtir were rafinekirin. Bi karanîna nirxa qutkirina FSC (Koreya Qalika Fourier) ya 0.143, çareseriyên modelên dawîn ên RC-LH114-W û RC-LH116 bi rêzê ve 2.65 û 2.80Å ne. Xêza FSC ya modela dawîn di Wêne 2. S17 de tê nîşandan.
Hemû rêzikên proteînê ji UniProtKB hatine dakêşandin: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) ji bo avakirina modelek homologiyê ya RC hate bikar anîn, ku rêzikên proteînê yên RC-L, RC-M û RC-H û avahiya krîstal a Rba.sphaeroides RC wekî şablonek hate bikar anîn (PDB ID: 5LSE) (46). Amûra "lihevhatina nexşeyê" ya di UCSF Chimera de bikar bînin da ku modela çêkirî li gorî nexşeyê (47) biguncînin, avahiya proteînê baştir bikin, û kofaktorê [4×BChl a (navê bermayiya pirtûkxaneya monomerê = BCL), 2×BPh a (BPH), yek an du cureyên UQ10 (U10), yek hesinê ne-hem (Fe) û yek 3,4-dihîdroheksakarbonîlkolîn (QAK)] bikar bînin da ku Coot (48) lê zêde bikin. Ji ber ku QAK di pirtûkxaneya monomerê de tune ye, ew bi karanîna amûra eLOW di PHENIX (49) de hate parametrekirin.
Piştre, yekîneya LH1 hate çêkirin. Di destpêkê de, amûra avakirina otomatîk di PHENIX (49) de hate bikar anîn da ku bixweber beşek ji rêza LH1 bi karanîna nexşeyê û rêzên proteîna LH1-α û LH1-β wekî têketin were çêkirin. Yekîneya LH1 ya herî temam hilbijêrin, wê derxînin û bar bikin nav Coot, rêza winda bi destan lê zêde bikin, û berî ku du BCl a (BCL) û spirilloxanthin (CRT) lê zêde bikin, tevahiya avahiyê bi destan safî bikin [li gorî Rps ya têkildar dendika kompleksa LH1 û naveroka karotenoîd a naskirî. Cure (17)]. Yekîneya LH1 ya tevahî kopî bikin, û "Amûra Nexşeya Docking" a UCSF Chimera bikar bînin da ku li herêma ne-model a cîran a dendika LH1 dor bikin, û dûv re wê di Coot de safî bikin; pêvajoyê dubare bikin heya ku hemî yekîneya LH1 werin model kirin. Ji bo avahiya RC-LH114-W, bi derxistina dendika nehatî veqetandin di Coot de, proteîn ji pêkhateyên ne-proteîn ên mayî di nexşeya USCF Chimera de tê veqetandin û amûra Autobuild ji bo sazkirina modela destpêkê û Modelkirina yekîneyên mayî (proteîn-W) tê bikar anîn. Di PHENIX (49) de. Her rêzek wenda li modela encam di Coot (48) de zêde bikin, û dûv re bi destan tevahiya yekîneyê safî bikin. Dendika nehatî veqetandin a mayî li gorî kombînasyona lîpîdan (ID-ya pirtûkxaneya monomer a PDB ya CDL = CDL, POPC = 6PL û POPG = PGT), deterjanê β-DDM (LMT) û molekulên UQ10 (U10) ye. Optimîzasyona PHENIX (49) û optimîzasyona destî di Coot (48) de bikar bînin da ku modela destpêkê ya tevahî bêkêmasî bikin heya ku statîstîkên modelê û kalîteya dîtbarî ya lihevhatinê nikaribin bêtir werin baştir kirin. Di dawiyê de, LocScale (50) bikar bînin da ku nexşeya herêmî tûj bikin, û dûv re çend çerxên din ên modelkirina dendika nehatî veqetandin û optimîzasyona otomatîk û destî pêk bînin.
Peptîd, kofaktor û lîpîd û kînonên din ên ku di nav dendikên xwe yên têkildar de hatine rêzkirin di Wêne 1 û 2 de têne nîşandan. S18 heta S23. Agahiyên îstatîstîkî yên modela dawî di Tabloya S1 de têne nîşandan.
Heger nehatibe diyarkirin, spektrumên vegirtina UV/Vis/NIR li ser spektrofotometreyek Cary60 (Agilent, USA) bi navberên 1 nm ji 250 nm heta 1000 nm û dema entegrasyonê ya 0.1 s hatin berhevkirin.
Nimûneyê di kuveteke quartzê de bi rêyeke 2 mm ber bi A880 ya 1 ve bihelînin, û spektruma vegirtinê di navbera 400 û 1000 nm de berhev bikin. Spektrumên dîkroîk ên dorhêlî li ser spektropolarimeterek Jasco 810 (Jasco, Japonya) di navberên 1 nm de di navbera 400 nm û 950 nm de bi rêjeya skankirinê ya 20 nm min-1 hatin berhevkirin.
Koefîsyenta tinebûna molar bi têkelkirina kompleksa bingehîn heta A880-ya nêzîkî 50-an tê destnîşankirin. Qebareya 10 μl di tampona girêdanê ya 990 μl an metanolê de têkel bikin, û spektruma vegirtinê tavilê berhev bikin da ku hilweşîna BChl kêm bikin. Naveroka BChl ya her nimûneya metanolê bi koefîsyenta tinebûnê ya li 771 nm ya 54.8 mM-1 cm-1 hate hesab kirin, û koefîsyenta tinebûnê hate destnîşankirin (51). Ji bo destnîşankirina konsantrasyona kompleksa bingehîn, têra BChl ya pîvandî bi 32 (RC-LH114-W) an 36 (RC-LH116) dabeş bikin, ku dûv re ji bo destnîşankirina spektruma vegirtinê ya heman nimûneya ku di tamponê de hatî berhev kirin tê bikar anîn. Koefîsyenta tinebûnê. paralel. Ji bo her nimûneyê sê pîvandinên dubare hatin girtin, û navînîya vegirtinê ya herî zêde ya BChl Qy ji bo hesabkirinê hate bikar anîn. Katsayiya tinebûnê ya RC-LH114-W ku di 878 nm de hatiye pîvandin 3280±140 mM-1 cm-1 e, lê katsayiya tinebûnê ya RC-LH116 ku di 880 nm de hatiye pîvandin 3800±30 mM-1 cm-1 e.
UQ10 li gorî rêbaza di (52) de hate hejmartin. Bi kurtasî, HPLC-ya qonaxa berevajî (RP-HPLC) bi karanîna pergala HPLC ya Agilent 1200 hate kirin. Nêzîkî 0.02 nmol RC-LH116 an RC-LH114-W di 50μl metanol:kloroforma 50:50 ku 0.02% (w/v) klorîda ferîk tê de heye de bihelînin, û Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm ya pêş-hevsengkirî derzî bikin. Di 1 ml-1 min-1 de di 40°C de di çareserkera HPLC (80:20 metanol:2-propanol) de li ser stûnek ×25 cm bihelînin. Elûsyona îzokratîk di çareserkera HPLC de pêk bînin da ku vegirtinê li 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoîd) û 780 nm (BChl) ji bo 1 saetê bişopînin. Lûtkeya di kromatograma 275 nm de di 25.5 hûrdeman de hate entegrekirin, ku ti pêkhateyên din ên tespîtker tê de tunebûn. Qada entegrekirî ji bo hesabkirina mîqdara molar a UQ10-ê ya ku hatiye derxistin bi referansa xêza kalibrasyonê ya ku ji derzîkirina standardên saf ji 0 heta 5.8 nmol hatî hesabkirin tê bikar anîn (Wêneya S14). Her nimûne di sê dubarekirinan de hate analîzkirin, û xeletiya ragihandî bi SD-ya navînî re têkildar e.
Çareseriyek ku kompleksa RC-LH1 tê de heye bi vegirtina Qy ya herî zêde 0.1 bi sîtokrom c2 ya dilê hespê ya kêmkirî ya 30 μM (Merck, Keyaniya Yekbûyî) û 0 heta 50 μMUQ2 (Merck, Keyaniya Yekbûyî) hate amadekirin. Sê nimûneyên 1 ml di her konsantrasyona UQ2 de hatin amadekirin û şevekê di tariyê de li 4°C hatin înkubasyon kirin da ku berî pîvandinê adaptasyona tevahî bi tariyê re were misoger kirin. Çareseriyek di spektrofotometreyek modular a OLIS RSM1000 de hate barkirin ku bi şebekeyek agir/xeta 500 nm, têketinek 1.24 mm, navîn 0.12 mm û derketinek 0.6 mm ve hatî sazkirin. Fîlterek derbasbûnê ya 600 nm dirêj li deriyê lûleya fotoya nimûneyê û lûleya fotopirjimara referansê tê danîn da ku ronahiya teşwîqkirinê were dûrxistin. Vegirtin li 550 nm bi demek entegrasyonê ya 0.15 s hate şopandin. Ronahiya teşwîqkirinê ji LED-a M880F2 (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) a 880 nm bi rêya kabloyek fîber optîk bi şîddeta %90 bi rêya kontrolkerek DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) tê derxistin û bi goşeyek 90° ber bi çavkaniya ronahiyê ve tê derxistin. Tîrêjê pîvandinê li hember neynikê ye da ku her ronahiya ku di destpêkê de ji hêla nimûneyê ve nehatiye kişandin vegerîne. Berî ronîkirina 50 saniyeyan 10 saniyeyan vegirtina vegirtinê bişopînin. Dûv re vegirtina vegirtinê ji bo 60 saniyeyan di tariyê de bêtir hate şopandin da ku were nirxandin ka kînolol çiqas bi awayekî xweber sîtokrom c23+ kêm dike (ji bo daneyên xav li Wêneya S8 binêre).
Daneyên bi rêya danîna rêjeyek destpêkê ya xêzikî di navbera 0.5 û 10 saniyeyan de (li gorî rêjeya UQ2) û navînîkirina rêjeyên her sê nimûneyan di her rêjeya UQ2 de hatin pêvajokirin. Rêjeya RC-LH1 ya ku ji hêla katsayiya vemirandinê ya têkildar ve hatî hesabkirin, ji bo veguherandina rêjeyê bo karîgeriya katalîtîk, ku di Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) de hatî xêzkirin, û li gorî modela Michaelis-Menten hate danîn da ku nirxên Km û Kcat ên xuya diyar bike.
Ji bo pîvandina vegirtina demkî, nimûneya RC-LH1 di tampona IMAC de ku 50 mM sodyûm askorbat (Merck, USA) û 0.4 mM Terbutin (Merck, USA) tê de heye, heta ~2μM hate şilkirin. Asîda askorbîk wekî donorek elektronê qurbanî tê bikar anîn, û tert-butaclofen wekî astengkerek QB tê bikar anîn da ku piştrast bike ku donorê sereke yê RC di tevahiya pêvajoya pîvandinê de kêm dimîne (ango, fotooksîdekirî nabe). Nêzîkî 3 ml nimûne li şaneyek zivirî ya xwerû (bi qasî 0.1 m di qutr, 350 RPM) bi dirêjahiya rêça optîkî ya 2 mm tê zêdekirin da ku piştrast bike ku nimûne di rêça lazerê de ji bo adaptasyona tarî di navbera pulsên teşwîqkirinê de demek têr heye. Pulsên lazerê yên ~100-fs bikar bînin da ku pergala lazerê Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) zêde bikin da ku nimûneyê li 880 nm bi rêjeya dubarekirinê ya 1 kHz (20 nJ ji bo NIR an 100 nJ ji bo Vis) teşwîq bikin. Berî berhevkirina daneyan, nimûneyê bi qasî 30 hûrdeman li ber ronahiya tehrîkkirinê bihêlin. Tehrîkkirin dê bibe sedema neçalakkirina QA (dibe ku QA carek an du caran kêm bike). Lê ji kerema xwe bala xwe bidinê ku ev pêvajo berevajî ye ji ber ku piştî demek dirêj a adaptasyona tariyê, RC dê hêdî hêdî vegere çalakiya QA. Spektrometreyek Helios (Ultrafast Systems, USA) ji bo pîvandina spektrumên demkî bi demek derengmayînê ya -10 heta 7000 ps hate bikar anîn. Nermalava Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) bikar bînin da ku setên daneyan ji hev veqetînin, dûv re bikin yek û standard bikin. Pakêta nermalava CarpetView (Light Conversion Ltd., Lîtvanya) bikar bînin da ku seta daneyên hevgirtî bikar bînin da ku spektrumên cûda yên têkildarî rizîbûnê bi dest bixin, an jî fonksiyonek bikar bînin ku gelek eksponentan bi bersiva amûrê re tevlihev dike da ku li gorî pêşveçûna spektruma yek-dirêjahiya pêlê di Origin (OriginLab, USA) de biguncîne.
Wekî ku li jor (53) hate behs kirin, fîlmek fotosentezê ku kompleksa LH1 dihewîne û hem RC û hem jî antenên LH2 yên periferîk tune ne, hate amadekirin. Parzûn di 20 mM tris (pH 8.0) de hate şilkirin û dûv re hate nav kuvetek quartz bi rêça optîkî ya 2 mm. Pulseke lazerê ya 30nJ ji bo teşwîqkirina nimûneyê li 540 nm bi demek derengmayînê ya -10 heta 7000 ps hate bikar anîn. Seta daneyan wekî ku ji bo nimûneya Rps.pal hatî vegotin pêvajo bikin.
Membran bi santrifujkirinê di 150,000 RCF de ji bo 2 saetan li 4°C hate peletkirin, û dûv re vegirtina wê ya di 880 nm de di 20 mM tris-HCl (pH 8.0) û 200 mM NaCl de ji nû ve hate süspendekirin. Membranê bi hêdî hêdî di nav 2% (w/v) β-DDM de ji bo 1 saet di tariyê de li 4°C de bihelînin. Nimûne di 100 mM triethylammonium karbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) de heta rêjeya proteînê ya 2.5 mg ml-1 hate şilkirin (analîza Bio-Rad). Pêvajoya din ji rêbaza berê ya weşandî (54) hate kirin, ku bi şilkirina 50 μg proteînê di nav tevahî 50 μl TEAB de ku 1% (w/v) sodyûm laurate (Merck, UK) tê de heye dest pê kir. Piştî sonîkasyonê bo 60 saniyeyan, ew bi 5 mM tris(2-karboksîetîl)fosfîn (Merck, Keyaniya Yekbûyî) di 37°C de bo 30 deqîqeyan hate kêmkirin. Ji bo S-alkîlasyonê, nimûne bi 10 mM metîl S-metiltîometansulfonat (Merck, Keyaniya Yekbûyî) ve were înkubasyonkirin û ji çareseriya stok a 200 mM îzopropanol bo 10 deqîqeyan li germahiya odeyê were zêdekirin. Heriskirina proteolîtîk bi zêdekirina 2 μg tevliheviya trîpsîn/endoproteînaz Lys-C (Promega Keyaniya Yekbûyî) hate kirin û bo 3 saetan li 37°C hate înkubasyonkirin. Surfaktantê laurat bi zêdekirina 50 μl etil asetat û 10 μl asîda trîfluoroasetîk a pola LC 10% (v/v) (TFA; Thermo Fisher Scientific, Keyaniya Yekbûyî) û 60 saniyeyan ve hate derxistin. Veqetandina qonaxê bi santrifujkirinê li 15,700 RCF bo 5 deqîqeyan hate pêşve xistin. Li gorî protokola çêker, stûneke spin C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) ji bo aspirasyon û bêxwêkirina bi baldarî ya qonaxa jêrîn a ku peptîd tê de hebû, hat bikar anîn. Piştî zuwakirina bi santrifujkirina valahiyê, nimûne di nav 0.5% TFA û 3% asetonîtrîlê de hat çareserkirin, û 500 ng bi kromatografiya nanoflow RP ve girêdayî bi spektrometriya girseyî ve bi karanîna parametreyên pergalê yên ku berê bi berfirehî hatine destnîşan kirin, hat analîzkirin.
Ji bo nasîn û hejmartina proteînê, ji bo lêgerîna databasa proteoma Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) MaxQuant v.1.5.3.30 (56) bikar bînin. Daneyên proteomîk ên spektrometriya girseyî bi rêya depoya hevkarê PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) di bin nasnameya daneyê PXD020402 de di Hevpeymaniya ProteomeXchange de hatine hilanîn.
Ji bo analîzkirina bi RPLC-ê ve girêdayî bi spektrometriya girseyî ya îyonîzasyona elektrospray, kompleksa RC-LH1 ji Rps-ya cureya kovî hate amadekirin. Bi karanîna rêbaza berê hatî weşandin (16), rêjeya proteîna ku di hucreyên palustris de hatî hilberandin 2 mg ml-1 di 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl û 0.03% (w/v) β- (analîza Bio-Rad) ) DDM de bû. Li gorî protokola çêker, ji bo derxistina 10 μg proteînê bi rêbaza barînê kîta paqijkirina 2D (GE Healthcare, USA) bikar bînin, û bermayî di 20 μl 60% (v/v) asîda formîk (FA), 20% (v/v) Asetonitrile û 20% (v/v) avê de bihelînin. Pênc mîkrolître bi RPLC (Dionex RSLC) ve girêdayî bi spektrometriya girseyî (Maxis UHR-TOF, Bruker) hatin analîzkirin. Ji bo veqetandinê di 60°C û 100μlmin -1 de, bi gradyanek ji %85 (v/v) çareserkerê A [%0.1 (v/v) FA û %0.02 (V/v) çareseriya avî ya TFA] heta %85 (v/v) çareserkerê B [%0.1 (v/v) FA û %0.02 (v/v) di %90 (v/v) asetonîtrîl TFA de], stûna MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) bikar bînin. Bi karanîna çavkaniya îyonîzasyona elektrospray a standard û parametreyên xwerû ji bo zêdetirî 60 hûrdeman, spektrometreya girseyî 100 heta 2750 m/z (rêjeya girseyî-ber-barkirinê) bi dest dixe. Bi alîkariya portala çavkaniyên biyoenformatîkê ya ExPASy amûra FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), spektruma girseyî li gorî yekîneyên kompleksê nexşe bikin.
Xane di bin ronahiya 100 ml NF-kêm (10μMm-2 s-1), navîn (30μMm-2 s-1) an jî bilind (300μMm-2 s-1) de ji bo 72 saetan hatin mezin kirin. Medyaya M22 (medyaya M22 ku tê de sulfata amonyûm tê derxistin û sûksînat sodyûm bi asetata sodyûm tê guhertin) di şûşeyek 100 ml ya bi serê pêçayî (23) de. Di pênc çerxên 30-çirkeyan de, morîkên camê yên 0.1 mîkron bi rêjeya qebareya 1:1 hatin çêkirin da ku xaneyan lîz bikin û 5 deqîqeyan li ser qeşayê hatin sar kirin. Maddeya neçareser, xaneyên neşikestî û morîkên camê bi santrifujkirinê di 16,000 RCF de ji bo 10 deqîqeyan di mîkrosantrifujek sermaseyê de hatin rakirin. Membran di rotorek Ti 70.1 de bi 100,000 RCF di 20 mM tris-HCl (pH 8.0) de bi gradyana şekir a 40/15% (w/w) ji bo 10 demjimêran hate veqetandin.
Wekî ku di xebata me ya berê de hatiye vegotin, tespîtkirina îmmunolojîk a nîşana His li ser PufW (16). Bi kurtasî, kompleksa bingehîn a paqijkirî (11.8 nM) an jî parzûna ku heman konsantrasyona RC (bi oksîdasyonê ve hatî destnîşankirin, spektruma cudahiya kêmkirî jê dike û barê li ser jela boyaxkirî li hev dike) di tampona barkirinê ya 2x SDS (Merck, UK) de du caran tê şilkirin. Proteîn li ser jelek NuPage ya bis-tris a 12% (Thermo Fisher Scientific, UK) hatin veqetandin. Jelek bi Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) hate boyaxkirin da ku jêr-yekîneya RC-L were barkirin û dîtin. Proteîna li ser jela duyemîn ji bo ceribandina îmmunolojîk hate veguheztin parzûna polîvînîlîdena fluorîd (PVDF) ya bi metanol-çalakkirî (Thermo Fisher Scientific, UK). Membrana PVDF di nav 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 û 5% (w/v) toza şîrê bê rûn de hate astengkirin, û dûv re bi antîkorê seretayî yê dij-His (di tampona antîkorê ya Dilute de [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl û 0.05% (v/v) Tween-20] di 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) ji bo 4 saetan hate înkubasyonkirin. Piştî şuştina 3 caran bo 5 xulekan di tampona antîkorê de, membran bi antîkorê duyemîn ê dij-mişkê peroksîdaza horseradish (Sigma-Aldrich, Keyaniya Yekbûyî) (di tampona antîkorê de 1:10,000 hatiye şilkirin) re hate tevlihevkirin. Ji bo tespîtkirinê (5 xulek piştî 3 şuştinan di tampona antîkorê de) bi karanîna substrata kemîlumînesansa WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Îtalya) û Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Keyaniya Yekbûyî) hate înkubasyonkirin da ku tespîtkirin gengaz bibe (5 xulek piştî 3 şuştinan di tampona antîkorê de).
Bi xêzkirina belavbûna şiddeta her jelê boyaxkirî an rêza ceribandina îmmuno, entegrekirina qada di bin lûtkeyê de û hesabkirina rêjeya şiddeta RC-L (jelê boyaxkirî) û Proteîn-W (îmmunoceribandin), di ImageJ (57) de. Wêneyê pêvajo bike. Ev rêje bi texmîna ku rêjeya RC-L beramberî proteîn-W di nimûneya RC-LH114-W ya saf de 1:1 bû û li gorî wê tevahiya seta daneyan normalîze kirin, veguherî rêjeyên molar.
Ji bo materyalên pêvek ên vê gotarê, ji kerema xwe li http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 binêrin.
Ev gotareke gihîştina vekirî ye ku li gorî şertên Lîsansa Afirîner a Peydakirina Afirîner (Creative Commons Attribution License) tê belavkirin. Gotar destûrê dide karanîn, belavkirin û kopîkirina bê sînor di her medyayê de bi şertê ku xebata orîjînal bi rêkûpêk were vegotin.
Têbînî: Em tenê ji we dixwazin ku hûn navnîşana e-nameya xwe bidin da ku kesê ku hûn pêşniyarî rûpelê dikin bizanibe ku hûn dixwazin ew e-nameyê bibînin û ew ne spam e. Em ê tu navnîşanên e-nameyan negirin.
Ev pirs ji bo ceribandina ka hûn mêvan in û pêşîgirtina şandina otomatîkî ya spamê tê bikar anîn.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Avahiya çareseriya bilind a kompleksa dafika ronahiyê 1 di navenda reaksiyonê de têgihiştinên nû li ser dînamîkên kînon peyda dike.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Avahiya çareseriya bilind a kompleksa dafika ronahiyê 1 di navenda reaksiyonê de têgihiştinên nû li ser dînamîkên kînon peyda dike.
©2021 Komeleya Amerîkî ji bo Pêşveçûna Zanistê. hemû maf parastî ne. AAAS hevparê HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef û COUNTER e. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.