Niha *Navnîşana niha: Köln 50931, Almanya, Lêkolîna Komela Serkeftinê ya Kölnê li ser Bersiva Stresa Hucreyî di Nexweşiyên Têkildarî Pîrbûnê de (CECAD).
Neurodejenerasyona nexweşiyên mîtokondrî wekî neguhêrbar tê hesibandin ji ber ku plastîkbûna metabolîk a neuronan bi sînor e, lê bandora nelirêtiya mîtokondrî li ser xweseriya hucreyê ya metabolîzma neuronan di laş de kêm tê famkirin. Li vir, em proteoma taybetî ya hucreyê ya neuronên Purkinje bi kêmasiya pêşverû ya OXPHOS-ê ya ku ji ber dînamîkên hevgirtina mîtokondrî yên têkçûyî çêdibe didin nasîn. Me dît ku nelirêtiya mîtokondrî guherînek kûr di warê proteomîkê de çêkir, ku di dawiyê de bû sedema çalakkirina berdewam a bernameyên metabolîk ên rast berî mirina hucreyê. Bi awayekî nediyar, me enzîma eşkere ya pîruvat karboksîlaz (PCx) û enzîmên din ên dijî-pîrbûnê yên ku navberên çerxa TCA temam dikin destnîşan kir. Astengkirina PCx stresa oksîdatîf û neurodejenerasyonê zêde kir, ku nîşan dide ku ateroskleroza bandorek parastinê li neuronên ku OXPHOS tune ye heye. Vegerandina hevgirtina mîtokondrî di neuronên ku di dawiyê de dejenerasyon bûne de van taybetmendiyên metabolîk bi tevahî berevajî dike, bi vî rengî pêşî li mirina hucreyê digire. Dîtinên me rêyên berê nenas destnîşan dikin ku berxwedanê didin nelirêtiya mîtokondrî û nîşan didin ku neurodejenerasyon dikare di qonaxên dereng ên nexweşiyê de jî were berevajîkirin.
Rola navendî ya mîtokondriyayan di parastina metabolîzma enerjiya neuronal de ji hêla nîşanên berfireh ên neurolojîk ên bi nexweşiyên mîtokondriyal ên mirovan ve girêdayî ve tê tekez kirin. Piraniya van nexweşiyan ji ber mutasyonên genan çêdibin ku îfadeya gena mîtokondriyal rêk dixin (1, 2) an jî hilweşandina genan a bi dînamîkên mîtokondriyal ve girêdayî ne, ku nerasterast bandorê li aramiya DNAya mîtokondriyal (mtDNA) dikin (3, 4). Xebata li ser modelên heywanan nîşan da ku di bersiva nelirêtiya mîtokondriyal di tevnên derdorê de, rêyên metabolîk ên muhafezekar (5-7) dikarin werin çalak kirin, ku agahdariya girîng ji bo têgihîştina kûr a patogeneza van nexweşiyên tevlihev peyda dike. Berevajî vê, têgihîştina me ya guhertinên metabolîk ên celebên hucreyên taybetî yên ku ji ber têkçûna giştî ya hilberîna adenozîn trîfosfat (ATP) ya mîtokondriyal a mêjî çêdibin bingehîn e (8), ku hewcedariya destnîşankirina hedefên dermankirinê yên ku dikarin ji bo pêşîlêgirtina an pêşîgirtina nexweşiyê werin bikar anîn tekez dike. Pêşî li dejenerasyona neuro (9) bigirin. Nebûna agahdariyê ew rastî ye ku hucreyên demarî bi berfirehî têne hesibandin ku nermbûna metabolîk a pir sînorkirî li gorî celebên hucreyên tevnên derdorê hene (10). Ji ber ku ev hucre roleke navendî di hevrêzkirina dabînkirina metabolîtan bo neuronan de dilîzin da ku veguhestina sînaptîk pêşve bibin û bersiva şert û mercên birîndarî û nexweşiyê bidin, şiyana adaptekirina metabolîzma hucreyê li gorî şert û mercên dijwar ên tevna mêjî hema hema bi hucreyên glial ve sînordar e (11-14). Wekî din, nehevsengiya hucreyî ya xwerû ya tevna mêjî bi giranî lêkolîna guhertinên metabolîk ên ku di binkomên neuronal ên taybetî de çêdibin asteng dike. Di encamê de, di derbarê encamên rastîn ên hucreyî û metabolîk ên nelirêtiya mîtokondrî di neuronan de hindik tê zanîn.
Ji bo têgihîştina encamên metabolîk ên nelirêtiya mîtokondrî, me neuronên Purkinje (PN) di qonaxên cûda yên dejenerasyona neuro de ku ji ber hilweşandina hevgirtina membrana derveyî ya mîtokondrî (Mfn2) çêbûne, veqetandin. Her çend mutasyonên Mfn2 di mirovan de bi celebek neuropatiya hestiyar a motorê ya mîratî ve girêdayî ne ku wekî celebê Charcot-Marie-Tooth 2A (15) tê zanîn, hilweşandina şertî ya Mfn2 di mişkan de rêbazek nelirêtiya oksîdasyonê ya Fosforîlasyonê (OXPHOS) ya baş-naskirî ye. Bin-celebên neuronal ên cûda (16-19) û fenotipa dejenerasyona neuro ya encam bi nîşanên neurolojîk ên pêşverû, wekî nexweşiyên tevgerê (18, 19) an ataksiya serebellar (16) re têne. Bi karanîna tevlîheviyek proteomîkên hejmarî yên bê-etîket (LFQ), metabolomîk, wênekirin û rêbazên vîrolojîk, em nîşan didin ku dejenerasyona neuro ya pêşverû bi tundî pîruvat karboksîlaz (PCx) û faktorên din ên ku di arterioskleroza PN-an de di vivo de beşdar in teşwîq dike. Derbirîna enzîman. Ji bo piştrastkirina girîngiya vê dîtinê, me bi taybetî îfadeya PCx di PN-yên kêmasiya Mfn2 de kêm kir, û dît ku ev operasyon stresa oksîdatîf zêde kir û dejenerasyona neuroyê bilez kir, bi vî rengî îspat kir ku azoospermî mirina şaneyê dide adaptebûna metabolîk. Îfadeya giran a MFN2 dikare PN-ya dejenerasyona termînal bi kêmasiya giran a OXPHOS, xerckirina girseyî ya DNA-ya mîtokondrî, û tora mîtokondrî ya xuya şikestî bi tevahî rizgar bike, ku bêtir tekez dike ku ev forma dejenerasyona neuroyê dikare di qonaxa pêşkeftî ya nexweşiyê de berî mirina şaneyê jî baş bibe.
Ji bo dîtina mîtokondriyên di PN-yên knockout ên Mfn2 de, me cureyek mişk bikar anî ku dihêle mîtokondriyên girêdayî Cre-ê îfadeya Cre ya proteîna fluoresan a zer (YFP) (mtYFP) (20) hedef bigirin û morfolojiya mîtokondriyê di vivo de kontrol kir. Me dît ku hilweşandina gena Mfn2 di PN-yan de dê bibe sedema dabeşbûna gav bi gav a tora mîtokondriyê (Wêne S1A), û guhertina herî zû di 3 hefteyan de hate dîtin. Berevajî vê, hilweşîna girîng a qata hucreya PN, wekî ku ji hêla windabûna boyaxkirina îmmuno ya Calbindin ve hatî îsbat kirin, heya 12 hefteyan dest pê nekir (Wêne 1, A û B). Nelihevhatina demê di navbera guhertinên herî zû yên di morfolojiya mîtokondriyê de û destpêka xuya ya mirina neuronal de me han da ku em lêkolîn bikin ka guhertinên metabolîk ên ku ji ber nefonksiyona mîtokondriyê berî mirina hucreyê çêdibin çi ne. Me stratejiyeke li ser bingeha rêzkirina hucreyên bi fluoresansa çalakkirî (FACS) pêşxist da ku PN-ya ku YFP (YFP+) îfade dike veqetînin (Wêne 1C), û di mişkên kontrolê de (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ku ji vir û pê ve wekî CTRL tê binavkirin (Wêne S1B). Optimîzasyona stratejiya derîkirinê li ser bingeha şiddeta nisbî ya sînyala YFP dihêle ku em laşê YFP+ (YFPhigh) ya PN-yan ji ne-PN-yan (YFPneg) (Wêne S1B) an perçeyên axon/dendritîk ên fluoresan ên texmînkirî (YFPlow; Wêne S1D, çep), ku bi mîkroskopa konfokal hatine piştrast kirin (Wêne S1D, rast), paqij bikin. Ji bo verastkirina nasnameya nifûsa dabeşkirî, me proteomîka LFQ û dûv re analîza pêkhateya sereke pêk anî, û dît ku di navbera hucreyên YFPhigh û YFPneg de cudahîyek zelal heye (Wêne S1C). Hucreyên YFPhigh nîşanekên PN-yên naskirî (ango Calb1, Pcp2, Grid2 û Itpr3) dewlemendkirinek net nîşan dan (21, 22), lê dewlemendkirina proteînên ku bi gelemperî di neuronan an celebên din ên hucreyan de têne îfade kirin tune bû (Wêne 1D). Berawirdkirinek di navbera nimûneyên di hucreyên YFPhigh ên dabeşkirî de ku di ceribandinên serbixwe de hatine berhevkirin de katsayiyek korelasyonê > 0.9 nîşan da, ku dubarebûnek baş di navbera dubarekirinên biyolojîkî de nîşan dide (Wêne S1E). Bi kurtasî, van daneyan plana me ji bo îzolekirina akût û taybetî ya PN-ya gengaz piştrast kir. Ji ber ku pergala ajokera L7-cre ya ku tê bikar anîn di hefteya yekem piştî zayînê de rekombînasyona mozaîk çêdike (23), me dest bi qirkirina mişkan ji CTRL û neuronên berhevkirina şertî (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) kir. Piştî ku rekombînasyon qediya, di 4 hefteyan de jê re Mfn2cKO tê gotin. Wekî xala dawîn, me temenê 8 hefteyan hilbijart ku tebeqeya PN tevî parçebûna eşkere ya mîtokondrî saxlem bû (Wêne 1B û Wêne S1A). Bi tevahî, me bi tevahî 3013 proteîn pîvand, ku ji wan nêzîkî 22% li ser bingeha anotasyonên MitoCarta 2.0 li ser bingeha proteoma mîtokondrî wekî mîtokondrî bûn (Wêne 1E) (Wêne 1E) (24). Analîza îfadeya genê ya cûda ku di hefteya 8-an de hate kirin nîşan da ku tenê 10.5% ji hemî proteînan guhertinên girîng hebûn (Wêne 1F û Wêne S1F), ku ji wan 195 proteîn kêm bûn û 120 proteîn zêde bûn (Wêne 1F). Hêjayî gotinê ye ku "analîza rêya nûjen" a vê koma daneyan nîşan dide ku genên ku bi cûda têne îfade kirin bi piranî aîdî komek sînorkirî ya rêyên metabolîk ên taybetî ne (Wêne 1G). Balkêş e ku her çend kêmkirina rêyên têkildarî OXPHOS û sînyalkirina kalsiyûmê teşwîqkirina bêfonksiyona mîtokondrî di PN-yên kêmasiya fusionê de piştrast dike jî, kategoriyên din ên ku bi giranî metabolîzma asîdên amînî vedihewînin bi girîngî zêde dibin, ku ev yek li gorî metabolîzma ku di PN-yên mîtokondrî de çêdibe ye. Ji nû ve girêdan domdar e. bêfonksiyon.
(A) Wêneyên konfokal ên nûner ên beşên serebellar ên mişkên CTRL û Mfn2cKO ku windabûna pêşverû ya PN-an (kalbindîn, gewr) nîşan didin; navik bi DAPI-yê hatin boyaxkirin. (B) Hejmarkirina (A) (analîza yek-alî ya guherînê, ***P<0.001; n = 4 heta 6 çember ji sê mişkan). (C) Herikîna xebatê ya ceribandinê. (D) Belavbûna nexşeya germê ya nîşankerên taybetî yên Purkinje (jor) û celebên din ên hucreyan (navîn). (E) Diyagrama Venn ku hejmara proteînên mîtokondrî yên ku di PN-ya dabeşkirî de hatine destnîşankirin nîşan dide. (F) Nexşeya Volkanê ya proteînên bi awayên cûda yên îfadekirî di neuronên Mfn2cKO de di 8 hefteyan de (nirxa qutkirina girîngiyê 1.3). (G) Analîza rêça afirîneriyê pênc rêyên rêziknameya jor (sor) û rêziknameya daketî (şîn) yên herî girîng di PN-ya Mfn2cKO de ku wekî 8 hefte hatine dabeşkirin nîşan dide. Asta navînî ya îfadeya her proteîna tespîtkirî tê nîşandan. Nexşeya germê ya pîvana gewr: nirxa P ya sererastkirî. ns, ne girîng e.
Daneyên proteomîkê nîşan dan ku derbirîna proteînê ya kompleksên I, III, û IV hêdî hêdî kêm bû. Kompleksên I, III, û IV hemî yekîneyên bingehîn ên kodkirî yên mtDNA dihewînin, lê kompleksa II, ku tenê kodkirî ya navokî bû, bi bingehîn bêbandor ma (Wêne 2A û Wêne S2A). Li gorî encamên proteomîkê, îmmunohîstokîmyaya beşên tevna serebellar nîşan da ku asta yekîneya MTCO1 (yekîneya 1 a oksîdaza sîtokrom C ya mîtokondrî) ya kompleksa IV di PN de hêdî hêdî kêm bû (Wêne 2B). Yekîneya kodkirî ya mtDNA Mtatp8 bi girîngî kêm bû (Wêne S2A), lê asta rewşa aram a yekîneya ATP sîntaza kodkirî ya navokî bêguherîn ma, ku ev yek bi kompleksa F1 ya kombûna ATP sîntaza aram a naskirî re lihevhatî ye dema ku derbirîna mtDNA aram be. Avabûn domdar e. Navber (7). Nirxandina asta mtDNA di PN-yên Mfn2cKO yên rêzkirî de bi rêya reaksiyona zincîra polîmeraz a demrast (qPCR) kêmbûna hêdî hêdî di hejmara kopiyên mtDNA de piştrast kir. Li gorî koma kontrolê, di 8 hefteyan de, tenê bi qasî %20ê asta mtDNA hate parastin (Wêne 2C). Li gorî van encaman, boyaxkirina mîkroskopiya konfokal a PN-yên Mfn2cKO ji bo tespîtkirina DNA-yê hate bikar anîn, ku xerckirina nukleotîdên mîtokondrî yên bi demê ve girêdayî nîşan dide (Wêne 2D). Me dît ku tenê hin namzetên ku di hilweşandina proteîna mîtokondrî û bersiva stresê de beşdar in, di nav de Lonp1, Afg3l2 û Clpx, û faktorên kombûna kompleksê OXPHOS, zêde bûn. Di astên proteînên ku di apoptozê de beşdar in de ti guhertinên girîng nehatin tespît kirin (Wêne S2B). Bi heman awayî, me dît ku kanalên mîtokondrî û retîkuluma endoplazmîk ên ku di veguhastina kalsiyûmê de beşdar in tenê guhertinên piçûk hene (Wêne S2C). Herwiha, nirxandina proteînên têkildarî otofajiyê ti guhertinên girîng nedît, ku ev yek lihevhatî ye bi înduksiyona xuya ya otofagozoman ku di vivo de bi rêya îmmunohîstokîmya û mîkroskopiya elektronê ve têne dîtin (Wêne S3). Lêbelê, nelirêtiya pêşverû ya OXPHOS di PN-an de bi guhertinên mîtokondrî yên ultrastrûktûrî yên eşkere re tê. Komên mîtokondrî dikarin di laşên hucreyan û darên dendrîtîk ên PN-yên Mfn2cKO yên 5 û 8 hefteyî de werin dîtin, û avahiya membrana hundurîn guhertinên kûr derbas kiriye (Wêne S4, A û B). Li gorî van guhertinên ultrastrûktûrî û kêmbûnek girîng di mtDNA de, analîza perçeyên cerebellar ên mejî yên tûj bi tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) nîşan da ku potansiyela membrana mîtokondrî di PN-yên Mfn2cKO de bi girîngî kêm bûye (Wêne S4C).
(A) Analîza demî ya asta derbirîna kompleksa OXPHOS. Tenê proteînên bi P<0.05 di hefteya 8an de bifikirin (ANOVA du-alî). Xeta xalxalî: Li gorî CTRL tu sererastkirin tune. (B) Çep: Nimûneyek ji beşek mejî ya ku bi antîkorê antî-MTCO1 hatiye nîşankirin (şira pîvanê, 20 μm). Qada ku ji hêla laşên hucreyên Purkinje ve hatî dagirkirin bi zer ve hatî nixumandin. Rast: Pîvandina astên MTCO1 (analîza yek-alî ya guherînê; n = 7 heta 20 hucreyên ji sê mişkan hatine analîzkirin). (C) Analîza qPCR ya jimara kopiyên mtDNA di PN-ya rêzkirî de (analîza yek-alî ya guherînê; n = 3 heta 7 mişk). (D) Çep: Nimûneyek ji perçeyek mejî ya ku bi antîkorê antî-DNA hatiye nîşankirin (şira pîvanê, 20 μm). Qada ku ji hêla laşên hucreyên Purkinje ve hatî dagirkirin bi zer ve hatî nixumandin. Rast: Pîvandina lezyonên mtDNA (analîza yek-alî ya guherînê; n = 5 heta 9 hucreyên ji sê mişkan). (E) Nimûneyek ji beşa serebellar a tûj ku şaneyên mitoYFP + Purkinje (tîr) di tomarkirina kelepçeya patch a tevahiya şaneyê de nîşan dide. (F) Hejmarkirina xêza IV. (G) Tomarkirinên nûner ên derzîkirina herika depolarîzekirinê di şaneyên CTRL û Mfn2cKO Purkinje de. Şopa jorîn: Yekem pulsa ku AP çalak kir. Şopa jêrîn: Frekansa AP ya herî zêde. (H) Hejmarkirina têketinên xweber ên postsînaptîk (sPSP). Şopa tomarkirina nûner û rêjeya zoomê ya wê di (I) de têne nîşandan. Analîza yekalî ya guherînê ji n = 5 heta 20 şaneyên ji sê mişkan analîz kir. Daneyên wekî navînî ± SEM têne îfade kirin; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Şopên nûner ên AP ya xweber bi karanîna moda kelepçeya patch a qulkirî hatine tomar kirin. Şopa jorîn: Frekansa AP ya herî zêde. Şopa jêrîn: zoomê AP-yek yekane. (K) Frekansa AP ya navînî û herî zêde li gorî (J) hejmar bike. Testa Mann-Whitney; n = 5 şaneyên ji çar mişkan hatin analîz kirin. Daneyên wekî navînî ± SEM têne îfade kirin; ne girîng e.
Zirara OXPHOS ya eşkere di PN ya Mfn2cKO ya 8-hefteyî de hate tespît kirin, ku nîşan dide ku fonksiyona fîzyolojîk a neuronan bi giranî anormal e. Ji ber vê yekê, me taybetmendiyên elektrîkî yên pasîf ên neuronên kêmasiya OXPHOS di 4 heta 5 hefte û 7 heta 8 hefteyan de bi pêkanîna tomarên clampên patch ên tevahiya şaneyê di perçeyên mejî yên akût de analîz kirin (Wêne 2E). Bi awayekî nediyar, potansiyela membrana bêhnvedanê ya navînî û berxwedana têketinê ya neuronên Mfn2cKO dişibin kontrolê, her çend cûdahiyên nazik di navbera şaneyan de hebûn (Tabloya 1). Bi heman rengî, di 4 heta 5 hefteyan de, di têkiliya niha-voltaja (xêza IV) de ti guhertinên girîng nehatin dîtin (Wêne 2F). Lêbelê, tu neuronên Mfn2cKO yên 7 heta 8 hefteyî ji rejîma IV (gava hîperpolarîzasyonê) sax neman, ku nîşan dide ku di vê qonaxa dereng de hesasiyetek eşkere ji bo potansiyela hîperpolarîzasyonê heye. Berevajî vê, di neuronên Mfn2cKO de, herikên depolarîzekirinê yên ku dibin sedema dakêşanên potansiyela çalakiya dubare (AP) baş têne tehmûlkirin, ku nîşan dide ku şêwazên dakêşana wan a giştî ji yên neuronên kontrolê yên 8-hefteyî ne pir cûda ne (Tabloya 1 û Wêneya 2G). Bi heman awayî, frekans û amplîtuda herikên postsînaptîk ên xweber (sPSC) bi yên koma kontrolê re berawirdî bûn, û frekansa bûyeran ji 4 hefteyan heta 5 hefteyan, ji 7 hefteyan heta 8 hefteyan bi zêdebûnek wekhev zêde bû (Wêne 2, H û I). Dema gihîştina sînaptîk di PN-an de (25). Encamên wekhev piştî perçeyên PN-ên qulkirî hatin bidestxistin. Ev veavakirin rê li ber tezmînata gengaz a kêmasiyên ATP-ya hucreyî digire, wekî ku dibe ku di tomarkirina kelepçeya perçeya tevahiya hucreyê de çêbibe. Bi taybetî, potansiyela membrana bêhnvedanê û frekansa agirkirina xweber a neuronên Mfn2cKO nehatin bandorkirin (Wêne 2, J û K). Bi kurtasî, ev encam nîşan didin ku PN-yên bi kêmasiya eşkere ya OXPHOS-ê dikarin bi şêweyên dakêşana frekanseke bilind re baş li hev bikin, ev yek nîşan dide ku mekanîzmayeke tezmînatê heye ku dihêle ew bersivên elektrofîzyolojîk ên nêzîkî normal biparêzin.
Daneyên wekî navînî ± SEM (analîza yekalî ya guherînê, testa berawirdkirina piralî ya Holm-Sidak; *P<0.05) têne îfade kirin. Hejmara yekîneyê bi parantezan tê nîşandan.
Me dest bi lêkolîna ka gelo di daneyên proteomîkê de (Wêne 1G) ti kategoriyek rêyên ku dikarin kêmasiya giran a OXPHOS-ê asteng bikin vedihewîne, bi vî rengî rave dike ka çima PN-ya bandorkirî dikare elektrofîzyolojiya nêzîkî normal biparêze (Wêne 2, E heta K). . Analîza proteomîkê nîşan da ku enzîmên ku di katabolîzma asîdên amînî yên zincîra şaxkirî (BCAA) de beşdar in bi girîngî zêde bûne (Wêne 3A û Wêne S5A), û hilbera dawîn asetil-CoA (CoA) an sûksînîl CoA dikare trîkarboksîlatan di çerxa Asîda arterosklerozê (TCA) de temam bike. Me dît ku naveroka BCAA transaminaz 1 (BCAT1) û BCAT2 her du jî zêde bûne. Ew gava yekem a katabolîzma BCAA-yê katalîz dikin bi çêkirina glutamate ji α-ketoglutarat (26). Hemû yekîneyên binî yên ku kompleksa keto asîd dehydrogenaz a zincîra şaxkirî (BCKD) pêk tînin, zêde têne rêkxistin (kompleks dekarboksîlasyona paşê û bêveger a îskeleta karbonê ya BCAA ya encam katalîze dike) (Wêne 3A û Wêne S5A). Lêbelê, di PN-ya rêzkirî de ti guhertinên eşkere di BCAA-yê de nehatin dîtin, ku dibe ku ji ber zêdebûna wergirtina hucreyî ya van asîdên amînî yên bingehîn an jî karanîna çavkaniyên din (glukoz an asîda laktîk) ji bo temamkirina çerxa TCA be (Wêne S5B). PN-yên ku OXPHOS tê de tune ne jî di 8 hefteyan de çalakiyên hilweşîn û transaminasyonê yên glutamine zêde nîşan dan, ku ev dikare bi zêdekirina enzîmên mîtokondrî glutaminase (GLS) û glutamine pîruvat transaminase 2 (GPT2) were nîşandan (Wêne 3, A û C). Hêjayî gotinê ye ku zêdebûna GLS bi îzoforma spliced ​​​​glutaminase C (GLS-GAC) ve sînorkirî ye (guherîna Mfn2cKO/CTRL bi qasî 4.5 qat e, P = 0.05), û zêdebûna wê ya taybetî di tevnên penceşêrê de dikare biyoenerjiya mîtokondrî piştgirî bike. (27).
(A) Nexşeya germê guherîna qatkirî ya asta proteînê ji bo rêya diyarkirî di hefteya 8an de nîşan dide. (B) Nimûneya perçeyek mejî ya ku bi antîkorê antî-PCx hatiye nîşankirin (şira pîvanê, 20 μm). Tîra zer ber bi laşê şaneya Purkinje ve nîşan dide. (C) Analîza derbirîna proteînê ya bi demî wekî namzetek girîng ji bo aterosklerozê hatiye destnîşankirin (test-t-ya pirjimar, *FDR <5%; n = 3-5 mişk). (D) Li jor: Diyagramek şematîk ku rêbazên cûda yên ketina karbona nîşankirî ya ku di nîşankera [1-13C]pîruvatê de heye nîşan dide (ango, bi rêya PDH an rêya trans-arterîal). Jêr: Nexşeya kemanê rêjeya karbona yek-nîşankirî (M1) nîşan dide ku piştî nîşankirina perçeyên mejî yên akût bi [1-13C]pîruvatê (test-t-ya cotkirî; ** P <0.01) veguheriye asîda aspartîk, asîda sîtrîk û asîda malîk. (E) Analîza dîroka demê ya berfireh a rêya nîşankirî. Tenê proteînên bi P<0.05 di hefteya 8an de bifikirin. Xêza xêzkirî: nirxa sererastkirinê tune (analîza du-alî ya guherînê; * P <0.05; *** P <0.001). Daneyên wekî navînî ± SEM têne îfade kirin.
Di analîza me de, katabolîzma BCAA bûye yek ji rêyên sereke yên zêdebûnê. Ev rastî bi tundî nîşan dide ku qebareya hewakirinê ya ku dikeve çerxa TCA dibe ku di PN-yên ku OXPHOS tê de tune be de were guhertin. Ev dibe ku formeke sereke ya ji nû ve girêdana metabolîk a neuronal temsîl bike, ku dibe ku bandorek rasterast li ser fîzyolojiya neuronal û zindîbûnê di dema parastina kêmasiya giran a OXPHOS de bike. Li gorî vê hîpotezê, me dît ku enzîma sereke ya antî-aterosklerotîk PCx zêde tê rêvebirin (Mfn2cKO/CTRL bi qasî 1.5 caran diguhere; Wêne 3A), ku veguherîna pîruvatê bo oksaloacetatê katalîze dike (28), ku tê bawerkirin ku di tevna mêjî de ye. Îfadeya di bi tenê bi astrosîtan ve sînorkirî ye (29, 30). Li gorî encamên proteomîkê, mîkroskopiya konfokal nîşan da ku îfadeya PCx bi taybetî û bi girîngî di PN-yên kêmasiya OXPHOS de zêde bû, di heman demê de reaktîvîteya PCx bi giranî bi hucreyên glial Bergmann ên cîran ên kontrolê ve sînorkirî bû (Wêne 3B). Ji bo ceribandina fonksiyonel a zêdebûna PCx-ê, me perçeyên mejî yên tûj bi nîşankera [1-13C]pîruvatê derman kirin. Dema ku pîruvat ji hêla pîruvat dehîdrojenaz (PDH) ve hate oksîdkirin, nîşana wê ya îzotopê winda bû , Lê dema ku pîruvat bi reaksiyonên damarî ve tê metabolîzekirin, di navberên çerxa TCA de cih digire (Wêne 3D). Ji bo piştgiriya daneyên me yên proteomîkê, me hejmareke mezin ji nîşankerên ji vê nîşankerê di asîda aspartîk a perçeyên Mfn2cKO de dîtin, di heman demê de asîda sîtrîk û asîda malîk jî meylek nerm hebû, her çend ne girîng be jî (Wêne 3D).
Di neuronên dopamînê yên mişkên MitoPark ên bi bêserûberiya mîtokondrî ji ber ku neuronên dopamînê bi taybetî gena faktora transkrîpsiyonê ya mîtokondrî A (Tfam) hilweşînin (Wêne S6B), îfadeya PCx jî bi girîngî zêde bû (31), ku nîşan dide ku arterioskleroza asîda asetonê. Hebûna nexweşiyê di dema bêserûberiya OXPHOS-a neuronal de di laş de tê rêkûpêk kirin. Hêjayî gotinê ye ku hatiye dîtin ku enzîmên bêhempa (32-34) ku dibe ku di neuronên ku dibe ku bi arteriosklerozê ve girêdayî bin de werin îfade kirin, di PN-yên ku OXPHOS tê de tune ne, wekî propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA propionyl-CoA vediguherîne succinyl-CoA û enzîma malîk a mîtokondrî 3 (ME3), ku rola wê ya sereke vegerandina pîruvatê ji malatê ye (Wêne 3, A û C) (33, 35). Herwiha, me zêdebûneke girîng di enzîma Pdk3 de dît, ku fosforîle dike û bi vî awayî PDH bêçalak dike (36), di heman demê de di enzîma Pdp1 de ku PDH çalak dike an jî di kompleksa enzîma PDH bi xwe de ti guhertin nehatin tespît kirin (Wêne 3A). Bi awayekî domdar, di PN-yên Mern2cKO de, fosforîlasyona yekîneya α1 α (PDHE1α) ya pêkhateya pîruvat dehydrogenaz E1 ya kompleksa PDH di Ser293 de (ku tê zanîn ku çalakiya enzîmê ya PDH asteng dike) zêde bû (Wêne S6C) (Wêne S6C). Pîruvat gihîştina damarî tune.
Di dawiyê de, me dît ku rêça super a bîyosenteza serîn û glîsînê, çerxa folata mîtokondrî (1C) ya têkildar û bîyosenteza prolînê (Wêne 1G û Wêne S5C) hemî, li gorî raporan, di dema pêvajoya çalakkirinê de bi girîngî têne zêdekirin. Tevnên derdorê bi bêserûberiya mîtokondrî têne çalakkirin (5-7). Analîza konfokal a ku van daneyên proteomîkê piştgirî dike nîşan da ku di PN-ê de bi nebûna OXPHOS, perçeyên serebellar ên mişkên 8-hefteyî rastî serîn hîdroksîmetîltransferaz 2 (SHMT2) hatin, ku enzîmek sereke ya çerxa folata mîtokondrî ye. Bersiva parastinê ya girîng (Wêne S5D). Di 13 perçeyên serebellar ên tûj ên ku bi CU-glukozê hatine înkubasyon kirin de, ceribandinên şopandina metabolîk zêdebûna bîyosenteza serîn û prolînê bêtir piştrast kirin, ku nîşan dide ku herikîna îzoformên karbonê ber bi serîn û prolînê ve zêde bûye (Wêne S5E). Ji ber ku reaksiyonên ku ji hêla GLS û GPT2 ve têne pêşve xistin berpirsiyarê senteza glutamate ji glutamîn û transaminasyona di navbera glutamate û α-ketoglutarat de ne, zêdebûna wan nîşan dide ku neuronên kêmasiya OXPHOS-ê daxwazek zêde ji bo glutamate heye. Ev dibe ku armanc ew be ku biyosenteza zêde ya prolînê were domandin (Wêne S5C). Berevajî van guhertinan, analîzek proteomîk a astrosîtên serebellar ji mişkên Mfn2cKO yên taybetî yên PN nîşan da ku ev rê (tevî hemî antîperoksîdazan) di îfadeyê de bi girîngî neguherîne, bi vî rengî nîşan dide ku Ev beralîkirina metabolîk ji bo PN-ya hilweşandî bijartî ye (Wêne S6, D heta G).
Bi kurtasî, van analîzan şêwazên cuda yên girîng ên çalakkirina demkî ya rêyên metabolîk ên taybetî di PN-an de eşkere kirin. Her çend fonksiyona mîtokondrî ya neasayî ya neuronal dikare bibe sedema ateroskleroza zû û ji nû ve çêkirina 1C (Wêne 3E û Wêne S5C), û tewra guhertinên pêşbînîkirî di îfadeya kompleksên I û IV de jî, guhertinên di senteza serine de novo de tenê di qonaxên dereng de eşkere bûn. Ev dîtin pêvajoyek rêzdar diyar dikin ku tê de mîtokondrî (çerxa 1C) û sîtoplazmayî (bîyosenteza serine) ya ji ber stresê bi hev re bi zêdebûna aterosklerozê di çerxa TCA de bersiv didin da ku metabolîzma neuronal ji nû ve şekil bidin.
PN-yên 8-hefteyî yên kêmasiya OXPHOS-ê dikarin çalakiya teşwîqkirina frekanseke bilind biparêzin û ji nû ve girêdana metabolîk a girîng derbas bikin da ku ji bo nelirêtiya mîtokondrî telafî bikin. Ev vedîtin îhtîmaleke balkêş derdixe holê ku heta di vê gavê de jî, ev hucre dikarin destwerdana dermankirinê bistînin da ku dejenerasyona neuro dereng bixin an jî pêşî lê bigirin. Dereng. Me ev îhtîmal bi du destwerdanên serbixwe çareser kir. Di rêbaza yekem de, me vektorek vîrusa adeno-girêdayî ya Cre (AAV) sêwirand da ku MFN2 bi awayekî bijartî di PN-yên kêmasiya OXPHOS-ê de di vivo de were îfade kirin (Wêne S7A). AAV-ya ku MFN2 kod dike û gena raportera floresan mCherry (Mfn2-AAV) di çandên neuronên seretayî de di vitro de hatin verast kirin, ku bû sedema ku MFN2 bi awayekî girêdayî Cre were îfade kirin û morfolojiya mîtokondrî rizgar kir, bi vî rengî pêşî li neuromutasyonê di neuronên Mfn2cKO de girt (Wêne S7, B, D û E). Piştre, me ceribandinên in vivo kirin da ku Mfn2-AAV-ya 8-hefteyî bi awayekî stereotaktîk radestî korteksa mejî ya mişkên Mfn2cKO û kontrolê bikin, û mişkên 12-hefteyî analîz kirin (Wêne 4A). Mişkên Mfn2cKO yên dermankirî mirin (Wêne 1, A û B) (16). Veguheztina vîrusî di vivo de bû sedema îfadeya bijartî ya PN di hin çemberên mejî de (Wêne S7, G û H). Derzîkirina AAV-ya kontrolê ku tenê mCherry îfade dike (Ctrl-AAV) bandorek girîng li ser pileya dejenerasyona neuroyê li heywanên Mfn2cKO nekir. Berevajî vê, analîza Mfn2cKO-yên ku bi Mfn2-AAV-yê ve hatine veguheztin bandorek parastinê ya girîng a qata hucreya PN nîşan da (Wêne 4, B û C). Bi taybetî, dendika neuronê xuya dike ku hema hema ji heywanên kontrolê nayê cûdakirin (Wêne 4, B û C, û Wêne S7, H û I). Derbirîna MFN1 lê ne MFN2 di xilaskirina mirina neuronal de bi heman rengî bi bandor e (Wêne 4C û Wêne S7, C û F), ku nîşan dide ku derbirîna MFN1 ya ektopîk dikare bi bandor kêmbûna MFN2 temam bike. Analîzên din di asta PN ya yekane de nîşan dan ku Mfn2-AAV bi piranî avahiya ultra ya mîtokondriyê rizgar kir, astên mtDNA normalîze kir, û derbirîna bilind a nîşana dij-anjîyogenezê PCx ​​berevajî kir (Wêne 4, C heta E). Muayeneya dîtbarî ya mişkên Mfn2cKO yên rizgarkirî di rewşa bêhnvedanê de nîşan da ku helwest û nîşanên motorê yên wan (tevgera S1 heta S3) baştir bûne. Di encamê de, ev ceribandin nîşan didin ku ji nû ve danasîna dereng a MFN2 di PN-yên ku bi giranî kêmasiya OXPHOS hene de têrê dike ku xerckirina mtDNA berevajî bike û aterosklerozê çêbike, bi vî rengî pêşî li dejenerasyona aksonê û mirina neuronal di vivo de digire.
(A) Nexşeyek ku bernameya ceribandinê ji bo derzîkirina AAV-ê ya ku MFN2 kod dike dema ku rêya metabolîk a destnîşankirî çalak dibe nîşan dide. (B) Wêneyên konfokal ên nûner ên perçeyên cerebellar ên 12-hefteyî yên ku di hefteya 8-an de di mişkên Mfn2cKO de hatine veguheztin û bi antîkorê antî-Calbindin hatine nîşankirin. Rast: Pîvana fîberên axonê. Pîvana zoomê ya axonê 450 û 75 μm e. (C) Çep: Pîvana dendika hucreya Purkinje di lûpa veguheztina AAV (AAV+) de (analîza yek-alî ya guherînê; n = 3 mişk). Rast: analîza fokusê ya mtDNA di PN-ya veguheztî de di hefteya 12-an de (test-t-ya nehevber; n = 6 hucreyên ji sê mişkan). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mîkrografên elektronê yên veguheztina nûner ên PN-yên beşên cerebellar ên Mfn2cKO yên ku bi vektorên vîrusî yên destnîşankirî veguheztî ne. Maska pembe qada ku dendrît lê dagirkirî nîşan dide, û çargoşeya xalxalî ya zer zoomê ya li rastê nîşan dide; n navikê temsîl dike. Xêza pîvanê, 1μm. (E) mînakek boyaxkirina PCx di PN de nîşan dide ku di 12 hefteyan de hatiye veguheztin. Xêza pîvanê, 20μm. OE, zêdeîfadekirin; FC, guherîna qatê.
Di dawiyê de, me girîngiya zindîbûna hucreyên ku ji hêla peroksîdazê ve têne çalak kirin di PN-yên ku kêmasiya OXPHOS-ê jiyan kirine de lêkolîn kir. Me mCherry çêkir ku AAV-shRNA (RNA-ya porê kurt) kod dike û bi taybetî mRNA-ya PCx ya mişk (AAV-shPCx) hedef digire, û vîrus an kontrola wê ya tevlihev (AAV-scr) xist nav mejî ya mişkên Mfn2cKO. Derzîkirin di hefteya çaremîn a temenê de hate kirin (Wêne 5A) da ku di heyama ku îfadeya PCx zêde bû (Wêne 3C) û qata hucreya PN hîn jî saxlem bû de kêmkirina PCx ya bi bandor were bidestxistin (Wêne 1A). Hêjayî gotinê ye ku kêmkirina PCx (Wêne S8A) dibe sedema lezbûnek girîng a mirina PN, ku bi xeleka vegirtî ve sînorkirî ye (Wêne 5, B û C). Ji bo têgihîştina mekanîzmaya bandorên metabolîk ên ji ber zêdebûna PCx-ê çêdibin, me rewşa redoks a PN-an piştî ku PCx knockdown û biyosensora optîkî ya bi navbeynkariya AAV Grx1-roGFP2 bi hevdemî hatin îfadekirin lêkolîn kir (Wêne S8, B heta D) da ku guhertina nisbî ya potansiyela redoks a peptîdê ya glutatyonê binirxînin (38). Dûv re, me mîkroskopiya wênekirina jiyanê ya fluoresansa du-foton (FLIM) di perçeyên mêjiyê tûj ên Mfn2cKO ya 7-hefteyî an jî hevalên kontrolê de pêk anî da ku guhertinên potansiyel ên di rewşa redoks a sîtoplazmayî de piştî verastkirina şert û mercên FLIM tespît bikin (Wêne S8, E heta G). Analîzê zêdebûnek girîng di rewşa oksîdasyonê ya yek PN-ya Mfn2cKO ya bê îfadeya PCx nîşan da, ku ji neuronên kontrolê an PN-yên Mfn2cKO yên ku tenê shRNA-ya tevlihev îfade dikin cuda ye (Wêne 5, D û E). Dema ku derbirîna PCx kêm bû, rêjeya PN-yên Mfn2cKO yên ku rewşek pir oksîdkirî nîşan didin ji sê qatan zêdetir zêde bû (Wêne 5E), ku nîşan dide ku zêdekirina PCx kapasîteya redoks a neuronên dejenerebûyî parastiye.
(A) Nexşeyek ku bernameya ceribandinê ji bo derzîkirina AAV-ê ya ku shPCx kod dike dema ku rêya metabolîk a destnîşankirî çalak dibe nîşan dide. (B) Wêneyên konfokal ên nûner ên beşên mejî yên 8-hefteyî di mişkên Mfn2cKO de ku di hefteya 4-an de bi antîkorê antî-kalsîneurîn hatine veguheztin û nîşankirin. Pîvana xêzikê, 450μm. (C) Pîvandina dendika hucreya Purkinje di lûpên veguheztî yên AAV de (analîza yek-alî ya guherînê; n = 3 heta 4 mişk). Daneyên wekî navînî ± SEM têne îfade kirin; ***P<0.001. (D) Wêneya FLIM ya nûner temenê navînî yê PN-ya 7-hefteyî ya ku sensora redoks a glutathione Grx1-roGFP2 di bin şert û mercên ceribandinê yên diyarkirî de nîşan dide. Rêjeya LUT (tabloya lêgerînê): navbera dema saxmayînê (bi pîkosaniyan). Pîvana xêzikê, 25μm. (E) Hîstogram belavkirina nirxên temenê Grx1-roGFP2 ji (D) (n=158 heta 368 şaneyên di du mişkan de di bin her şert û mercî de) nîşan dide. Nexşeya pî ya li jor her hîstogramê: hejmara şaneyên bi nirxên temenê wan ên bi girîngî dirêjtir (sor, oksîdekirî) an kurttir (şîn, kêmkirî) nîşan dide, ku ji 1 SD ya nirxa temenê navînî di CTRL-AAV-scr de derbas dibin. (F) Modela pêşniyarkirî bandora parastinê ya zêdebûna PCx ya neuronal nîşan dide.
Bi tevayî, daneyên ku em li vir peyda dikin nîşan didin ku ji nû ve îfadekirina MFN2 dikare PN-ya pêşketî ya bi kêmasiya giran a OXPHOS, kêmbûna giran a mtDNA, û morfolojiya ista-yê ya pir anormal bi tevahî rizgar bike, bi vî rengî pêşveçûnek domdar peyda dike, tewra di nexweşiyên pêşketî de jî. Neurodejenerasyon delîlên berevajî yên qonaxa berî mirina hucreyê peyda dike. Ev asta nermbûna metabolîk ji hêla şiyana neuronan ve ji bo teşwîqkirina aterosklerozê (ji nû ve sazkirina çerxa TCA) bêtir tê tekez kirin, ku îfadeya PCx di PN-yên ku OXPHOS tune ne asteng dike û mirina hucreyê zêde dike, bi vî rengî rolek parastinê dilîze (Wêne 5F).
Di vê lêkolînê de, me delîl pêşkêş kirin ku bersiva PN-yan ji bo bêserûberiya OXPHOS ew e ku hêdî hêdî bi rêya rêça çalakkirina cûdahiyê ya ku ji hêla bernameyên metabolîk ve tê çalak kirin, bigihêje ateroskleroza çerxa TCA. Me analîza proteomîk bi gelek rêbazên temamker piştrast kir û eşkere kir ku dema ku bi bêserûberiya giran a mîtokondrî re rû bi rû dimînin, neuron xwedî formek elastîkbûna metabolîk a berê nenas in. Ji bo surprîza me, tevahiya pêvajoya ji nû ve girêdanê ne hewce ye ku rewşa metabolîk a termînal nîşan bide ku bi dejenerasyona neuro re hêdî hêdî û bêveger tê, lê daneyên me pêşniyar dikin ku ew dikare neuronek parastinê pêk bîne, tewra di qonaxa berî mirina hucreyê de jî. Mekanîzma tezmînata fonksiyonel. Ev dîtin nîşan dide ku neuron di laş de xwedî pileyek girîng a plastîkbûna metabolîk in. Ev rastî îspat dike ku ji nû ve danasîna MFN2-ê ya paşê dikare îfadeya nîşankerên metabolîk ên sereke berevajî bike û pêşî li dejenerasyona PN bigire. Berevajî vê, ew aterosklerozê asteng dike û demaran lez dike. transseksuel.
Yek ji dîtinên herî balkêş di lêkolîna me de ev e ku PN-yên ku OXPHOS tê de tune ne dikarin metabolîzma çerxa TCA bi zêdekirina enzîmên ku bi taybetî arteriosklerozê teşwîq dikin biguherînin. Ji nû ve rêzkirina metabolîk taybetmendiyek hevpar a şaneyên penceşêrê ye, ku hin ji wan ji bo temamkirina navberên çerxa TCA ji bo hilberandina hevsengên kêmker, ku zincîra respirasyonê dimeşînin û hilberîna pêşengên bîyosenteza lîpîd û nukleotîdê didomînin, xwe dispêrin glutamine (39, 40). Lêkolînek vê dawiyê nîşan da ku di tevnên periferîk ên ku bêserûberiya OXPHOS dijîn de, ji nû ve girêdana metabolîzma glutamine/glutamate jî taybetmendiyek berbiçav e (5, 41), ku rêça ketina glutamine nav çerxa TCA bi giraniya birîndariya OXPHOS ve girêdayî ye (41). Lêbelê, delîlên zelal li ser her wekheviya plastîkbûna metabolîk a neuronal di laş de û girîngiya wê ya gengaz di çarçoveya nexweşiyê de tune ne. Di lêkolînek vê dawiyê ya in vitro de, hate nîşandan ku neuronên kortîkal ên seretayî ji bo veguhestina neuro hewzên glutamate seferber dikin, bi vî rengî metabolîzma oksîdatîf û aterosklerozê di bin şert û mercên stresa metabolîk de pêşve dixin (42). Hêjayî gotinê ye ku di bin astengkirina farmakolojîk a enzîma çerxa TCA succinate dehydrogenase de, tê bawerkirin ku karboksîlasyona pîruvatê senteza oksaloasetatê di neuronên granulên cerebellar ên çandî de diparêze (34). Lêbelê, girîngiya fîzyolojîk a van mekanîzmayan ji bo tevna mêjî (ku tê bawerkirin ku ateroskleroza bi giranî bi astrosîtan ve sînorkirî ye) hîn jî girîngiya fîzyolojîk a girîng heye (43). Di vê rewşê de, daneyên me nîşan didin ku PN-yên ku ji hêla OXPHOS ve di laş de zirar dîtine dikarin werin veguheztin bo hilweşandina BCAA û karboksîlasyona pîruvatê, ku du çavkaniyên sereke yên temamkirina navberên hewza TCA ne. Her çend beşdariya texmînkirî ya katabolîzma BCAA-yê di metabolîzma enerjiya neuronal de hatiye pêşniyar kirin jî, ji bilî rola glutamate û GABA-yê ji bo veguhestina neuron (44), hîn jî delîl ji bo van mekanîzmayan di vivo de tune. Ji ber vê yekê, hêsan e ku meriv texmîn bike ku PN-yên nefonksiyonel dikarin bixweber xerckirina navberên TCA-yê ku ji hêla pêvajoya asîmîlasyonê ve têne rêve kirin bi zêdekirina aterosklerozê telafî bikin. Bi taybetî, zêdebûna PCx dibe ku ji bo domandina daxwaza zêde ya asîda aspartîk hewce be, ku ev yek di hucreyên pirbûnê yên bi bêserûberiya mîtokondrî de tê pêşniyar kirin (45). Lêbelê, analîza me ya metabolomîk di asta rewşa aram a asîda aspartîk de di PN-yên Mfn2cKO de ti guhertinên girîng eşkere nekir (Wêne S6A), ku tê texmîn kirin ku karanîna metabolîk a cûda ya asîda aspartîk di navbera hucreyên pirbûnê û neuronên piştî mîtotîk de nîşan dide. Her çend mekanîzmaya rastîn a zêdebûna PCx di neuronên bêserûber de di vivo de hîn jî nayê destnîşankirin, me nîşan da ku ev bersiva zû rolek girîng di parastina rewşa redoks a neuronan de dilîze, ku di ceribandinên FLIM de li ser perçeyên cerebellar hate nîşandan. Bi taybetî, pêşîgirtina li zêdebûna PCx ji hêla PN ve dikare bibe sedema rewşek oksîdekirîtir û mirina hucreyê bileztir bike. Aktîvkirina hilweşîna BCAA û karboksîlasyona pîruvatê ne rêbazên ji bo destnîşankirina tevnên periferîk ên bêserûberiya mîtokondrî ne (7). Ji ber vê yekê, ew xuya dikin ku taybetmendiyek sereke ya neuronên kêmasiya OXPHOS in, her çend ne tenê taybetmendî bin jî, ku ji bo dejenerasyona neuro girîng e.
Nexweşiya mejî cureyekî heterojen ê nexweşiya dejenerasyona mejî ye ku bi gelemperî wekî ataksiyê xwe nîşan dide û pir caran zirarê dide PN-yan (46). Ev nifûsa neuronan bi taybetî ji nelirêtiya mîtokondrî re xeternak e ji ber ku hilweşîna wan a bijartî di mişkan de têrê dike ku gelek nîşanên motorê yên ku taybetmendiya ataksiya spînoserebellar a mirovan diyar dikin ji nû ve hilberîne (16, 47, 48). Li gorî raporan, modelek mişkek transgenîk bi genek mutant bi ataksiya spînoserebellar a mirovan ve girêdayî ye û nelirêtiya mîtokondrî heye (49, 50), ku girîngiya lêkolîna encamên kêmasiya OXPHOS di PNPH de tekez dike. Ji ber vê yekê, ew bi taybetî guncan e ku bi bandor vê nifûsa neuronên bêhempa were veqetandin û lêkolîn kirin. Lêbelê, ji ber ku PN ji zextê re pir hesas in û rêjeyek kêm ji tevahiya nifûsa hucreyên mejî pêk tînin, ji bo gelek lêkolînên li ser bingeha omîkê, veqetandina bijartî ya wan wekî hucreyên tevahî hîn jî aliyek dijwar e. Her çend hema hema ne gengaz be ku meriv nebûna tevahî ya kontaminasyonê ya celebên din ên şaneyan (bi taybetî şaneyên mezinan) bi dest bixe, me gaveke veqetandina bi bandor bi FACS re kir yek da ku hejmareke têr a neuronên zindî ji bo analîza proteomîk a jêrîn bi dest bixin, û li gorî daneyên heyî yên tevahiya mejî, vegirtina proteînê ya pir zêde (nêzîkî 3000 proteîn) hebe (51). Bi parastina zindîbûna şaneyên tevahî, rêbaza ku em li vir peyda dikin dihêle ku em ne tenê guhertinên di rêyên metabolîk ên di mîtokondriyê de kontrol bikin, lê di heman demê de guhertinên di hevpîşeyên wê yên sîtoplazmayî de jî kontrol bikin, ku karanîna etîketên membrana mîtokondriyê ji bo dewlemendkirina celebê şaneyê temam dike. Rêbaza nû ji bo hejmara mîtokondriyê di şaneyên tevlihev de (52, 53). Rêbaza ku em diyar dikin ne tenê bi lêkolîna şaneyên Purkinje ve girêdayî ye, lê dikare bi hêsanî li ser her celeb şaneyê were sepandin da ku guhertinên metabolîk di mejiyên nexweş de, di nav de modelên din ên nefonksiyona mîtokondriyê, çareser bike.
Di dawiyê de, me di vê pêvajoya ji nû ve rêzkirina metabolîk de pencereyeke dermankirinê destnîşan kir ku dikare nîşanên sereke yên stresa hucreyî bi tevahî berevajî bike û pêşî li hilweşîna neuronal bigire. Ji ber vê yekê, têgihîştina bandorên fonksiyonel ên ji nû ve girêdana ku li vir hatî vegotin dikare têgihiştinên bingehîn li ser dermankirinên gengaz ji bo parastina zindîbûna neuronal di dema nefonksiyona mîtokondrî de peyda bike. Lêkolîna pêşerojê ya ku armanc dike ku guhertinên di metabolîzma enerjiyê de di celebên din ên hucreyên mêjî de analîz bike, hewce ye ku bi tevahî sepandina vê prensîbê ji bo nexweşiyên din ên neurolojîk eşkere bike.
Mişkên MitoPark berê hatine vegotin (31). Mişkên C57BL/6N yên bi genên Mfn2 yên li kêleka loxP berê hatine vegotin (18) û bi mişkên L7-Cre re hatine xaçkirin (23). Paşê nifşên heterozîgot ên ducarî yên encam bi mişkên Mfn2loxP/Mfn2loxP yên homozîgot re hatin xaçkirin da ku ji bo Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) knockoutên gena taybetî ya Purkinje çêbibin. Di komek ji hevjînkirinê de, alela Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) bi rêya xaçkirinên zêde hate nasandin (20). Hemî prosedurên heywanan li gorî rêbernameyên Ewropî, neteweyî û sazûmanî hatin kirin û ji hêla LandesamtfürNatur ya Umwelt û Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Almanya ve hatin pejirandin. Xebata li ser heywanan her weha rêberiya Federasyona Ewropî ya Komeleyên Zanistên Heywanên Laboratîfê dişopîne.
Piştî bêhişkirina cihê malzarokê yê jina ducanî, embriyoya mişk tê veqetandin (E13). Korteks di Çareseriya Xwêya Balanskirî ya Hanks (HBSS) de ku bi 10 mM Hepes hatiye zêdekirin, hate parçekirin û li ser Dulbecco's Modified Eagle's Medium ku papain (20 U/ml) û cysteine ​​​​(1μg/ml) tê de heye, hate derbaskirin. Tevn di DMEM de tê înkubasyonkirin) û bi helandina enzîmatîk veqetînin. Ml) di 37°C de ji bo 20 hûrdeman, û dûv re bi awayekî mekanîkî di DMEM de ku bi 10% seruma fetal a ga hatiye zêdekirin, hate hûrkirin. Hucre li ser bergên cam ên ku bi polîlîzîn hatine pêçandin bi dendika 2×106 di her kaseya çandiniyê ya 6 cm de an jî bi dendika 0.5×105 hucre/cm2 ji bo analîza wênekirinê hatin çandin. Piştî 4 demjimêran, navgîn bi navgîna bê serûm a Neurobasal ku lêzêdekirina B27 ya 1% û 0.5 mM GlutaMax tê de heye, hate guheztin. Piştre neuron di tevahiya ceribandinê de di 37°C û 5% CO2 de hatin parastin, û heftê carekê hatin xwarin. Ji bo teşwîqkirina ji nû ve kombînasyonê di vitro de, 3μl (tasa çandiniyê ya 24-qulî) an 0.5μl (tasa 24-qulî) ji vektora vîrusa AAV9 ya jêrîn ji bo dermankirina neuronan di roja duyemîn de di vitro de hat bikar anîn: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, hejmara katalogê 105530-AAV9) û AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, hejmara katalogê 105545-AAV9).
DNAya temamker a Mfn1 û Mfn2 ya mişk (bi rêzê ve ji plazmîda Addgene #23212 û #23213 hatine wergirtin) li C-termînusê bi rêza V5 (GKPIPNPLLGLDST) hatine nîşankirin, û bi rêya rêza T2A di çarçoveyê de bi mCherry re têne yekkirin. Grx1-roGFP2 diyariyek ji Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) e. Bi guhertina kaseta tdTomato bi karanîna rêbazên klonkirina kevneşopî, kaset di nav stûna pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (hejmara referansa Addgene 28306) de hate subklonkirin da ku vektorên pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 û pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 çêbike. Stratejiyeke dişibihe vê ji bo çêkirina vektora kontrolê pAAV-CAG-FLEX-mCherry hate bikaranîn. Ji bo çêkirina avahiya AAV-shPCx, vektoreke plazmîdî ya AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) pêwîst e, ku rêza DNAyê ya ku shRNAya ku PCx ya mişk hedef digire kod dike (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) dihewîne. Di bin kontrola promotera U6 de, mCherry di bin kontrola promotera CMV de tê bikaranîn. Hilberîna vektorên alîkar ên AAV li gorî rêwerzên çêker (Cell Biolabs) hate kirin. Bi kurtasî, plazmîdek veguhastinê bikar bînin ku mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) hildigire. Veguheztina demkî ya şaneyên 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) an gena kodkirina Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), û her weha proteîna kapsîd a AAV1 kod dike û plazmîda plazmîda pakkirina proteîna alîkar, bi karanîna rêbaza fosfata kalsiyûmê. Serpereşta vîrusê ya xav bi çerxên cemidandin-helandinê di hemama qeşaya hişk/etanolê de hate bidestxistin û şaneyan di şorbeya tamponkirî ya fosfatê (PBS) de hate lîz kirin. Vektora AAV bi ultrasantrifujasyona gradienta iodixanol a bênavber (24 demjimêr di 32,000 rpm û 4°C de) hate paqijkirin û bi karanîna fîltera santrifuj a Amicon ultra-15 hate konsantrekirin. Tîtera genoma AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 kopiya genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX wekî ku berê hatiye vegotin (54) bû, bi PCR-ya hejmarî ya demrast (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) û AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) hate pîvandin.
Nêronên seretayî di PBS-ya sar a 1x de hatin xêzkirin, pelet kirin, û dûv re di tampona lîzê ya 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodyûm deoksîkolat/PBS-ê de ku fosfataz û astengkerê proteazê tê de heye (Roche) homojen kirin. Pîvandina proteînê bi karanîna ceribandina asîda bîsîncînînîk (Thermo Fisher Scientific) hate kirin. Dûv re proteîn bi elektroforeza jela SDS-polyacrylamide veqetiyan, û dûv re li ser membrana polîvînîlîden florîd (GE Healthcare) hatin blot kirin. Cihên ne-taybetî asteng bikin û bi antîkorê seretayî (ji bo hûrguliyan li Tabloya S1 binêrin) di şîrê 5% di TBST (şorba Tris-tamponkirî bi Tween re), gavên şuştinê û antîkorê duyemîn di TBST Incubate de înkub bikin. Bi antîkorê seretayî re tevahiya şevê li +4°C înkub bikin. Piştî şuştinê, antîkorê duyemîn 2 saetan di germahiya odeyê de bidin ser. Piştre, bi înkubasyona heman blotê bi antîkorê antî-β-aktîn, heman barkirin hate piştrast kirin. Tesbîtkirin bi veguherandina bo kîmylumînesansê û zêdekirina kîmylumînesansê (GE Healthcare).
Nêronên ku berê li ser bergên cam hatibûn çandin, di dema diyarkirî de bi %4 paraformaldehyde (PFA)/PBS di germahiya odeyê de ji bo 10 deqîqeyan hatin sabît kirin. Bergên pêşî bi %0,1 Triton X-100/PBS ji bo 5 deqîqeyan di germahiya odeyê de hatin permeabilkirin, û dû re jî di tampona astengkirinê de [3% albûmîna seruma ga (BSA)/PBS]. Di roja duyemîn de, bergên bi tampona astengkirinê hatin şuştin û bi antîkorê duyemîn ê bi fluorofor ve girêdayî yê guncaw ji bo 2 saetan di germahiya odeyê de hatin înkubasyonkirin; di dawiyê de, nimûne bi tevahî di PBS de bi 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) hatin boyaxkirin û dû re bi Aqua-Poly/Mount li ser slayta mîkroskopê hatin sabît kirin.
Mişk (nêr û mê) bi derzîkirina ketamîn (130 mg/kg) û ksîlazîn (10 mg/kg) di nav perîtonê de hatin bêhişkirin û bi rêya jêrzemînê analjezîka karprofen (5 mg/kg) hatin dayîn. Û di amûrek stereotaktîk (Kopf) de hatin danîn ku pêçek germ lê hatiye danîn. Qoqê vekin û bi karanîna makîneya diranan beşa korteksa mejî ya ku bi hestiyê mis re têkildar e (ji lambda: dûvik 1.8, lateral 1, ku bi lobulên IV û V re têkildar e) zirav bikin. Bi karanîna derziyek şîrîng a qurmiçî, bi baldarî qulikek piçûk di qoqê de çêbikin da ku rê li ber têkçûna damarên jêrîn bigirin. Dûv re kapîlara cam a zirav a xêzkirî hêdî hêdî têxe nav mîkro-qulikê (ji -1.3 heta -1 li aliyê ventral ê dura mater), û 200 heta 300 nl AAV bi şîrîngên destan (Narishige) çend caran bi zexta nizm di pencereyek 10 heta 20 hûrdeman de têxe nav mîkro-derzîkerê (Narishige). Piştî înfuzyonê, kapîlar 10 deqîqeyên din têxin cihê xwe da ku vîrus bi tevahî belav bibe. Piştî ku kapîlar têne kişandin, çerm bi baldarî tê dirûtin da ku iltîhaba birînê kêm bibe û heywan baş bibe. Heywan piştî emeliyatê çend rojan bi dermanên êşbir (caspofen) hatin dermankirin, di vê demê de rewşa wan a fîzîkî bi baldarî hate şopandin û dûv re di wextê diyarkirî de hatin kuştin. Hemû prosedur li gorî rêbernameyên Ewropî, neteweyî û saziyan hatin kirin û ji hêla LandesamtfürNatur ya Umwelt û Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Almanya ve hatin pejirandin.
Heywan bi ketamîn (100 mg/kg) û ksîlazîn (10 mg/kg) hatin bêhişkirin, û dil pêşî bi 0.1 M PBS, û dû re jî bi 4% PFA di PBS de hate perfuzkirin. Tevn di 4°C de şevekê di 4% PFA/PBS de hate parçekirin û sabît kirin. Ji bo amadekirina beşên sagîtal (50 μm stûr) ji mêjiyê sabît di PBS de kêrek lerzok (Leica Microsystems GmbH, Viyana, Avusturya) hate bikar anîn. Heger nehatibe diyarkirin, boyaxkirina beşên azad-herikîn wekî ku li jor hatî vegotin (13) di germahiya odeyê de û tevdanê hate kirin. Bi kurtasî, pêşî, perçeyên bidestxistî bi 0.5% Triton X-100/PBS ji bo 15 hûrdeman di germahiya odeyê de hatin permeabilîzekirin; ji bo hin epîtopan (Pcx û Shmt2), bi tampona tris-EDTA di 80°C (PH 9) de perçeyan ji bo 25 hûrdeman germ bikin li şûna vê gavê. Piştre, beş bi antîkorê seretayî (li Tabloya S1 binêre) di tampona astengkirinê (3% BSA/PBS) de di 4°C de bi şev û bi tevdanê hatin înkubasyonkirin. Roja din, beş bi tampona astengkirinê hatin şuştin û bi antîkorê duyemîn ê bi floroforê ve girêdayî yê guncaw re 2 saetan di germahiya odeyê de hatin înkubasyonkirin; di dawiyê de, beş bi tevahî di PBS de hatin şuştin, bi DAPI-yê boyaxkirin, û dûv re bi AquaPolymount-ê li ser slaytek mîkroskopê hatin sabît kirin.
Mîkroskopek konfokal a şopandina lazerê (TCS SP8-X an TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ku bi lazerek ronahiya spî û lazerek ultraviyole ya dîyoda 405 ve hatî sazkirin, ji bo wênekirina nimûneyê hate bikar anîn. Bi teşwîqkirina fluoroforê û berhevkirina sînyalê bi Detektora Hîbrîd (HyDs), nermalava LAS-X ji bo berhevkirina wêneyên stûkirî yên li gorî nimûnegirtina Nyquist di moda rêzdar de hate bikar anîn: ji bo panelên ne-hejmarî, ew sînyalên pir dînamîk in (mînakî, di hucreyên somatîk û dendrîtan de) mtYFP) HyD bikar bînin da ku hejmara PN-an di moda BrightR de tespît bikin). Dergehkirin ji 0.3 heta 6 ns tê sepandin da ku paşxaneyê kêm bike.
Wênekirina demrast a şaneyên rêzkirî. Piştî rêzkirinê di navgîna Neurobasal-A de ku ji %1 pêveka B27 û 0.5 mM GlutaMax pêk tê, şane tavilê li ser slaytên cama bi polî-l-lîzînê pêçayî (μ-Slide8 Well, Ibidi, hejmara katalogê 80826) hatin çandin, û dûv re ji bo 1 saetê li 37°C û %5 CO2 hatin hiştin da ku şane bicîh bibin. Wênekirina demrast li ser mîkroskopa konfokal a şopandina lazer a Leica SP8 ku bi lazerek spî, HyD, lenzek objektîfa rûnê 63×[vebûna hejmarî ya 1.4 (NA)] û qonaxek germkirinê ve hatî çêkirin, hate kirin.
Mişk bi lez û bez bi karbondîoksîtê hat bêhişkirin û serê wî hat jêkirin, mêjî bi lez ji serê wî hat derxistin û bi qalindahiya 200μm (ji bo ceribandina nîşankirina 13C) an jî 275μm (ji bo ceribandinên du fotonan) beşa sagîtal bi materyalên jêrîn hat birîn. Qeşa (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Almanya) bi van madeyan hatiye dagirtin: 125 mM sar-qeşagirtî, karbon-têrkirî (95% O2 û 5% CO2) şileya mêjî ya çêkirî ya Ca2 kêm + (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, tampona fosfata sodyûmê 1.25 mM, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukoz, 0.5 mM CaCl2 û 3.5 mM MgCl2 (zexta osmotîk ji 310 heta 330 mmol). Perçeyên mêjî yên bidestxistî veguhezînin odeyeke pêş-înkubasyonê ku tê de Ca2 + ACSF-ya bilindtir (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampona sodyûm fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukoz, 1.0 mM CaCl2 û 2.0 mM MgCl2) heye (Navçeya pH 7.4 û 310 heta 320 mmol).
Di dema pêvajoya wênekirinê de, perçe hatin veguhastin odeyeke wênekirinê ya taybet, û ceribandin di bin perfuzyona domdar a ACSF de di germahiyek sabît a 32° heta 33°C de hate kirin. Mîkroskopek şopandina lazer a pirfotonî (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ku bi lenzek objektîf a Leica 25x (NA 0.95, av), lazera Ti: Safîr (Chameleon Vision II, Coherent) ve hatî sazkirin, ji bo wênekirina perçeyan hate bikar anîn. Modula FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM ya Grx1-roGFP2. Guhertinên di rewşa redoks a sîtoplazmayî ya PN-an de bi FLIM-a du-fotonî di perçeyên mêjî yên sagîtal de hatin pîvandin, ku biyosensorê Grx1-roGFP2 PN-an hedef girt. Di qata PN-ê de, qada bidestxistinê bi qasî 50 heta 80 μm li binê rûyê perçeyê tê hilbijartin da ku piştrast bike ku PN-yek guncan heye (ango, nebûna avahiya morfolojîk an guhertinên morfolojîk ên neuronal li ser dendrîtan) û sensora roGFP2 ya ducar erênî û AAV-ya ku shRNA PCx an rêza kontrola wê kod dike (her yek mCherry bi hev re îfade dike). Wêneyên yek-stûnî bi zoom-a dîjîtal a 2x berhev bikin [dirêjahiya pêlê ya teşwîqkirinê: 890 nm; 512 nm 512 pîksel]. Tesbîtkirin: HyD-ya navxweyî, koma fîlterê ya îzotîyosîyanata flûoresceîn (FITC)] û navînîkirina wêneyê di nav 2 heta 3 hûrdeman de têne bikar anîn da ku piştrast bikin ku fotonên têr têne berhev kirin (bi tevahî 1000 foton) ji bo guncandina xêzê. Hestiyariya proba Grx1-roGFP2 û verastkirina şert û mercên FLIM bi şopandina nirxa temenê roGFP2 dema ku 10 mM H2O2 ya eksojen li perfuzyona ACSF zêde kirin (ji bo zêdekirina oksîdasyonê, di encamê de temenê dirêj dibe), û dûv re zêdekirina 2 mM dithiothreitol (pileya kêmkirinê kêm dike, di encamê de temenê dirêj dibe) hatin kirin (Wêneya S8, D heta G). Nermalava FLIMfit 5.1.1 bikar bînin da ku encamên bidestxistî analîz bikin, xêza hilweşîna eksponansiyel a yekane ya tevahiya wêneyê li IRF-ya pîvandî (fonksiyona bersiva amûrê) bicîh bikin, û χ2 bi qasî 1 e. Ji bo hesabkirina temenê PN-yek yekane, maskeya li dora laşê demarê bi destan hate xêzkirin, û temenê navînî di her maskeyê de ji bo hejmartinê hate bikar anîn.
Analîza potansiyela mîtokondrî. Piştî ku beşa akût bi 100 nM TMRM-ê ku rasterast li ACSF-ya perfûzkirî ji bo 30 hûrdeman hate zêdekirin, guhertinên potansiyela mîtokondrî ya PN-an bi mîkroskopa du-fotonî hatin pîvandin. Wênekirina TMRM-ê bi eksîyonkirina probê li 920 nm û bi karanîna HyD-ya navxweyî (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) ji bo berhevkirina sînyalan hate kirin; bi karanîna heman dirêjahiya pêlê ya eksîyonê lê bi karanîna HyD-ya navxweyî ya cûda (FITC: 525/50) ji bo wênekirina mtYFP-ê hate kirin. Ji bo nirxandina potansiyela mîtokondrî di asta şaneya yekane de pêveka Hesabkera Wêneyê ya ImageJ-ê bikar bînin. Bi kurtasî, hevkêşeya pêvekê: sînyal = min (mtYFP, TMRM) ji bo destnîşankirina herêma mîtokondrî tê bikar anîn ku sînyala TMRM-ê di Somaliya Purkinje de di wêneya konfokal a yek-stûk a kanala têkildar de nîşan dide. Dûre qada pîkselê ya di maskeya encam de tê hejmartin, û dûv re li ser wêneya yek-stek a eşikê ya têkildar a kanala mtYFP tê normalîzekirin da ku rêjeya mîtokondrî ya ku potansiyela mîtokondrî nîşan dide were bidestxistin.
Wêne bi nermalava Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) hate zelalkirin. Ji bo wêneyên skankirî yên kaxetan, montajkirina yek kaxetî bi karanîna algorîtmaya dirûtina otomatîk a ku ji hêla nermalava LAS-X ve hatî peyda kirin tê çêkirin. Piştî kalibrkirina wêneyê, ImageJ û Adobe Photoshop bikar bînin da ku wêneyê bêtir pêvajo bikin û ronahî û kontrastê bi rengek yekreng rast bikin. Ji bo amadekirina grafîkî Adobe Illustrator bikar bînin.
Analîza fokusê ya mtDNA. Hejmara lezyonên mtDNA li ser beşên mejî yên ku bi antîkorên li dijî DNA-yê hatine nîşankirin, bi mîkroskopa konfokal hate hejmartin. Her deverek hedef ji bo laşê şaneyê û navika her şaneyê hate afirandin, û deverek têkildar bi karanîna pêveka Pir-Measure (nermalava ImageJ) hate hesabkirin. Devera navokî ji deverek laşê şaneyê derxînin da ku deverek sîtoplazmayî were bidestxistin. Di dawiyê de, pêveka Analyze Particles (nermalava ImageJ) hate bikar anîn da ku xalên DNA-ya sîtoplazmayî yên ku mtDNA-yê li ser wêneya eşik nîşan didin bixweber were hejmartin, û encamên hatine bidestxistin li gorî navîniya PN ya mişkên CTRL hatin normalîzekirin. Encam wekî hejmara navînî ya nukleozîdan li ser her şaneyê têne diyar kirin.
Analîza îfadeya proteînê. Ji bo nirxandina îfadeya proteînê di PN de di asta şaneya yekane de, pêveka Image Calculator a ImageJ bikar bînin. Bi kurtasî, di wêneya konfokal a yek-qatî ya kanala têkildar de, bi rêya hevkêşeya: sînyal = min (mtYFP, antîkor), herêma mîtokondrî ya ku li hember antîkorek diyarkirî di Purkina de îmmunoreaktîvîteyê nîşan dide tê destnîşankirin. Dûv re qada pîkselê ya di maskeya encam de tê hejmartin, û dûv re li ser wêneya yek-stûn a eşikê ya têkildar a kanala mtYFP tê normalîzekirin da ku rêjeya mîtokondrî ya proteîna nîşandayî were bidestxistin.
Analîza dendika şaneyên Purkinje. Plugina Cell Counter a ImageJ ji bo nirxandina dendika Purkinje bi dabeşkirina hejmara şaneyên Purkinje yên hatine jimartin li ser dirêjahiya xeleka mejî ya ku ji hêla şaneyên jimartî ve hatî dagirkirin hate bikar anîn.
Amadekirin û berhevkirina nimûneyan. Mejiyê ji koma kontrolê û mişkên Mfn2cKO di nav 2% PFA/2.5% glutaraldehyde di tampona fosfatê ya 0.1 M (PB) de hatin sabît kirin, û dûv re beşên koronal bi karanîna ciliatan (Leica Mikrosysteme GmbH, Viyana, Avusturya) hatin amadekirin (Stûrbûn 50 heta 60 μm). Dûv re di tampona PB de di nav 1% os tetraoxide û 1.5% potassium ferrocyanide de di germahiya odeyê de ji bo 1 saetê hatin sabît kirin. Beş sê caran bi ava distîlekirî hatin şuştin, û dûv re bi 70% etanolê ku 1% uranyl asetat tê de heye ji bo 20 deqîqeyan hatin boyaxkirin. Dûv re beş di alkola pilekirî de hatin zuwakirin û di nav rezîna epoksî ya Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, hejmara katalogê 14040) de di navbera slaytên cama bi silîkonê pêçayî de hatin bicihkirin, û di dawiyê de di 60°C de ji bo 48 saetan di firinê de polîmerîze kirin. Beşa korteksa mejî (cerebellar cores) hat hilbijartin û beşên ultra zirav ên 50 nm li ser Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viyana, Avusturya) hatin birîn û li ser toreke şikestina sifir a 2×1 mm ku bi fîlma polîstîrenê hatibû pêçandin hatin hilbijartin. Beş bi çareseriya 4% uranyl asetat di H2O de ji bo 10 deqîqeyan hatin boyaxkirin, çend caran bi H2O hatin şuştin, dû re 10 deqîqeyan bi sîtrata rêber a Reynolds di H2O de hatin şuştin, û dû re çend caran bi H2O hatin şuştin. Mîkrograf bi mîkroskopa elektronîkî ya veguheztinê Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bi karanîna kamerayek dîjîtal a TVIPS (Sîstema Pêvajoya Vîdyo û Wêneyê ya Tietz) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA) hatin kişandin. Almanya).
Ji bo mişkên bi AAV vegirtî, mejî hate veqetandin û di beşek sagîtal a 1 mm stûr de hate birîn, û mejî bi karanîna mîkroskopa fluoresansê hate lêkolîn kirin da ku zengila bi AAV vegirtî (ango, îfadeya mCherry) were destnîşankirin. Tenê ceribandinên ku tê de derzîkirina AAV dibe sedema karîgeriya veguheztinê ya pir bilind a qata hucreya Purkinje (ango hema hema tevahiya qatê) di herî kêm du zengilên mejî yên li pey hev de têne bikar anîn. Xeleka veguheztî ya AAV ji bo piştî-fiksasyonê di şevekê de hate mîkrodisekirin (4% PFA û 2.5% glutaraldehyde di tampona kokoatê ya 0.1 M de) û bêtir hate hilberandin. Ji bo bicihkirina EPON, tevna sabît bi tampona sodyûm kokoatê ya 0.1 M (Applichem) hate şuştin, û bi 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) di tampona sodyûm kokoatê ya 0.1 M de (Applichem) 4 Saetan hate înkubasyon kirin, dûv re 2 saetan hate şuştin. 3 caran bi tampona kokamîdê ya 0.1 M dubare bikin. Paşê, rêzeya etanolê ya ber bi jor ve hat bikaranîn da ku her çareseriya etanolê 15 deqîqeyan di 4°C de were înkubasyonkirin da ku tevn bê zuwakirin. Tevn bo propîlen oksîdê hat veguheztin û şevekê di EPON (Sigma-Aldrich) de di 4°C de hate înkubasyonkirin. Tevn bo 2 saetan di germahiya odeyê de di EPON-a teze de bihêlin, û dû re 72 saetan di 62°C de bicîh bikin. Bi karanîna ultramîkrotomek (Leica Microsystems, UC6) û kêrek elmasê (Diatome, Biel, Swîsre) beşên ultra zirav ên 70 nm bibirrin, û bi 1.5% uranyl asetat boyax bikin boyax bikin boyax bikin boyax bikin boyax bikin boyax bikin boyax bikin boyax bikin boyax bikin boyax bikin boyax bikin boyax bikin. Mîkrografên elektronê bi karanîna mîkroskopa elektronê ya veguheztinê ya JEM-2100 Plus (JEOL) ku bi Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) û nermalava DigitalMicrograph (Gatan) ve hatî çêkirin, hatin girtin. Ji bo analîzê, mîkrografên elektronî bi zoomê dîjîtal 5000× an 10,000× hatin girtin.
Analîza morfolojîk a mîtokondriyan. Ji bo hemû analîzan, konturên mîtokondriyên takekesî bi destan di wêneyên dîjîtal de bi karanîna nermalava ImageJ hatine xêzkirin. Parametreyên morfolojîk ên cûda têne analîzkirin. Densiya mîtokondriyan wekî rêjeyek tê îfadekirin ku bi dabeşkirina tevahiya qada mîtokondriyal a her şaneyê li ser qada sîtoplazmayê (qada sîtoplazmayê = qada şaneyê-qada navika şaneyê) × 100 tê bidestxistin. Girûbûna mîtokondriyan bi formula [4π∙(qad/perîmetre 2)] tê hesibandin. Morfolojiya ista ya mîtokondriyan hate analîzkirin û li gorî şeklên wan ên sereke li du kategoriyan ("tubular" û "blister") hate dabeşkirin.
Analîza hejmar û tîrbûna otofagozom/lîzozomê. Nermalava ImageJ bikar bînin da ku bi destan konturên her otofagozom/lîzozomê di wêneya dîjîtal de xêz bikin. Rûbera otofagozom/lîzozomê wekî rêjeyek tê îfadekirin ku bi dabeşkirina rûbera avahiya tevahî ya otofagozom/lîzozomê ya her şaneyê li ser rûbera sîtoplazmayê (rûbera sîtoplazmayê = rûbera şaneyê-rûbera navikê) × 100 tê hesibandin. Tîrbûna otofagozom/lîzozoman bi dabeşkirina hejmara giştî li ser hejmara avahiyên otofagozom/lîzozomê yên her şaneyê (bi warê rûbera sîtoplazmîk) (rûbera sîtoplazmîk = rûbera şaneyê-rûbera navikê) tê hesibandin.
Etîketkirin ji bo perçekirina akût û amadekirina nimûneyê. Ji bo ceribandinên ku hewceyê etîketkirina glukozê ne, perçeyên mêjiyê akût veguhezînin odeyek pêş-înkubasyonê, ku karbona têrbûyî (95% O2 û 5% CO2), Ca2 + ACSF-ya bilind (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampona sodyûm fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukoz, 1.0 mM CaCl2 û 2.0 mM MgCl2, ku ji bo pH 7.4 û 310 heta 320 mOsm hatîye sererast kirin), ku tê de glukoz 13C6- Guhertina glukozê ye (Eurisotop, hejmara katalogê CLM-1396). Ji bo ceribandinên ku nîşankirina pîruvatê hewce dikin, perçeyên mêjiyê tûj veguhezînin bo Ca2 + ACSF-ya bilindtir (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampona sodyûm fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukoz, 1.0 mM CaCl2 û 2.0mM MgCl2 lê zêde bikin, pH-ê li gorî 7.4 û 310 heta 320mOsm rast bikin), û 1mM 1-[1-13C]pîruvat (Eurisotop, hejmara katalogê CLM-1082) lê zêde bikin. Beşan 90 deqîqeyan li 37°C înkubasyon bikin. Di dawiya ceribandinê de, beş bi çareseriyek avî (pH 7.4) ku 75 mM karbonata amonyûm tê de heye, zû hatin şuştin, û dûv re di 40:40:20 (v:v:v) asetonîtrîl (ACN): metanol: av de homojenîze kirin. Piştî ku beş 30 deqîqeyan li ser qeşayê hatin înkubasyonkirin, nimûne di 21,000 g de ji bo 10 deqîqeyan di 4°C de hatin santrifujkirin, û supernatantê zelal di konsantratorek SpeedVac de hate hişk kirin. Peleta metabolîtê ya hişkkirî ya encam heya analîzê di -80°C de hate hilanîn.
Analîza kromatografiya şil-spektrometriya girseyî ya 13 asîdên amînî yên bi C-nîşankirî. Ji bo analîza kromatografiya şil-spektrometriya girseyî (LC-MS), peleta metabolîtê di 75μl ava pola LC-MS (Honeywell) de ji nû ve hate süspendekirin. Piştî santrifujkirinê li 21,000 g ji bo 5 deqîqeyan li 4°C, 20 μl ji supernatantê zelalkirî ji bo analîza herikîna asîda amînî hate bikar anîn, dema ku mayîya ekstraktê tavilê ji bo analîza anyonê hate bikar anîn (li jêr binêre). Analîza asîda amînî bi karanîna protokola derivatîzasyona benzoyl chloride ya ku berê hatî vegotin (55, 56) hate kirin. Di gava yekem de, 10μl ji 100 mM karbonata sodyûmê (Sigma-Aldrich) li 20μl ekstrakta metabolîtê hate zêdekirin, û dûv re 10μl ji 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) li ACN-ya pola LC hate zêdekirin. Nimûne demek kurt hate vortexkirin û dû re ji bo 5 deqeyan di 20°C de di 21,000 g de hate santrifujkirin. Supernatantê paqijkirî veguhezînin şûşeyek oto-nimûnekirinê ya 2 ml bi pêvekek cam a konîk (qebareya 200 μl). Nimûne bi karanîna pergala LC ya performansa ultra-bilind a Acquity iClass (Waters) ku bi spektrometreya girseyî ya rastbûna çareseriya bilind a Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific) ve girêdayî ye, hatin analîzkirin. Ji bo analîzê, 2 μl ji nimûneya derivatîzekirî di stûnek silîka T3 ya bihêz a 100×1.0 mm (Waters) de ku perçeyên 1.8μm tê de hene, hate derzîkirin. Rêjeya herikînê 100μl/min e, û pergala tamponê ji tampona A (10 mM formata amonyûm û 0.15% asîda formîk di avê de) û tampona B (ACN) pêk tê. Gradient wiha ye: 0%B di 0 deqeyan de; 0%B. 0 heta 15% B di 0 heta 0.1 deqîqeyan de; 15 heta 17% B di 0.1 heta 0.5 deqîqeyan de; B di 17 heta 55% di 0.5 heta 14 deqîqeyan de; B di 55 heta 70% di 14 heta 14.5 deqîqeyan de; di 14.5 heta 70 heta 100% B di 18 deqîqeyan de; 100% B di 18 heta 19 deqîqeyan de; 100 heta 0% B di 19 heta 19.1 deqîqeyan de; 0% B di 19.1 heta 28 deqîqeyan de (55, 56). Spektrometra girseyî ya QE-HF di moda îyonîzasyona pozîtîf de bi rêjeya girseyî ya m/z (rêjeya girseyî/barkirinê) ya 50 heta 750 dixebite. Çareseriya sepandî 60,000 e, û hedefa îyonê ya kontrola qezencê (AGC) ya hatî bidestxistin 3×106 e, û dema îyonê ya herî zêde 100 milîçirke ye. Çavkaniya îyonîzasyona elektrospray (ESI) ya germkirî bi voltaja spray ya 3.5 kV, germahiya kapîler a 250°C, herikîna hewayê ya qalikê ya 60 AU (yekîneyên keyfî), û herikîna hewayê ya alîkar a 20 AU. 250°C dixebite. Lensa S li ser 60 AU hatîye danîn.
Analîza kromatografiya anyonî-MS ya asîdên organîk ên nîşankirî yên 13C. Bermayiya metabolîtê ya mayî (55μl) bi karanîna pergala kromatografiya îyonî ya Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ku bi spektrometreyek girseyî ya QE-HF (Thermo Fisher Scientific) ve girêdayî ye, hate analîzkirin. Bi kurtasî, 5μl ji ekstrakta metabolîtê di moda çerxa qismî ya push-in de bi rêjeya dagirtinê ya 1 hate derzîkirin nav stûnek Dionex IonPac AS11-HC ku bi HPLC (2 mm × 250 mm, mezinahiya perçeyan 4μm, Thermo Fisher Scientific) ve hatî sazkirin. ) Stûna parêzvan a Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific) hate danîn. Germahiya stûnê li 30°C tê parastin, û otosampler li ser 6°C tê danîn. Kartuşek hîdroksîda potasyûmê ya ku bi ava deîyonîzekirî ve hatî peyda kirin bikar bînin da ku gradientek hîdroksîda potasyûmê bi rêya jeneratora eluentê çêbikin. Veqetandina metabolîtan bi rêjeya herikîna 380μl/min, bi sepandina gradyana jêrîn: 0 heta 3 deqe, 10 mM KOH; 3 heta 12 deqe, 10 heta 50 mM KOH; 12 heta 19 deqe, 50 heta 100 mM KOH; 19 heta 21 deqe, 100 mM KOH; 21 heta 21.5 deqe, 100 heta 10 mM KOH. Stûn di bin 10 mM KOH de ji bo 8.5 deqeyan ji nû ve hate hevsengkirin.
Metabolîtên elutekirî piştî stûnê bi herikeke pêveka îzopropanolê ya 150μl/min re têne tevlihevkirin û dûv re ber bi spektrometreyeke girseyî ya çareseriya bilind ve têne rêvekirin ku di moda îyonîzasyona neyînî de dixebite. MS rêza girseyî ji m/z 50 heta 750 bi çareseriya 60,000 dişopîne. AGC li ser 1×106 hatiye danîn, û dema îyonê ya herî zêde li 100 ms tê girtin. Çavkaniya ESI ya germkirî bi voltaja spreyê ya 3.5 kV hate xebitandin. Mîhengên din ên çavkaniya îyonê wiha ne: germahiya kapîler 275°C; herikîna gaza qalikê, 60 AU; herikîna gaza alîkar, 20 AU li 300°C, û mîhengkirina lensa S li ser 60 AU.
Analîza daneyên metabolîtên nîşankirî yên bi 13C. Ji bo analîza daneyên rêjeya îzotopê nermalava TraceFinder (guhertoya 4.2, Thermo Fisher Scientific) bikar bînin. Nasnameya her terkîbê ji hêla terkîbek referansê ya pêbawer ve hate verast kirin û bi serbixwe hate analîz kirin. Ji bo ku analîza dewlemendkirina îzotopê were kirin, qada kromatograma îyonê ya derxistî (XIC) ya her îzotopa 13C (Mn) ji [M + H]+ hate derxistin, ku n hejmara karbonê ya terkîba hedef e, ku ji bo analîzkirina asîdên amînî tê bikar anîn an jî [MH]+ ji bo analîzkirina anyonan tê bikar anîn. Rastbûna girseyî ya XIC ji pênc beşên ji mîlyonê kêmtir e, û rastbûna RT 0.05 hûrdem e. Analîza dewlemendkirinê bi hesabkirina rêjeya her îzotopa tespîtkirî bi berhevoka hemî îzotopên terkîba têkildar re tê kirin. Ev rêje wekî nirxên sedî ji bo her îzotopê têne dayîn, û encam wekî rêjeya dewlemendkirina molar (MPE) têne diyar kirin, wekî ku berê hatiye vegotin (42).
Peleta neuronê ya cemidî di nav metanola 80% (v/v) a sar de homojenîze bû, bi vorteksê hate tevlihevkirin û 30 deqîqeyan di -20°C de hate înkubasyonkirin. Nimûneyê dîsa bi vorteksê tevlihev bikin û 30 deqîqeyan di +4°C de tevlihev bikin. Nimûne di 21,000 g de ji bo 5 deqîqeyan di 4°C de hate santrifujkirin, û dûv re supernatantê encam hate berhevkirin û bi karanîna konsentratorek SpeedVac di 25°C de ji bo analîza paşîn hate hişk kirin. Wekî ku li jor hatî vegotin, analîza LC-MS li ser asîdên amînî yên şaneyên rêzkirî hate kirin. Bi karanîna TraceFinder (guhertoya 4.2, Thermo Fisher Scientific), analîza daneyan bi karanîna girseya monoîzotopîk a her pêkhateyê hate kirin. Normalîzasyona hejmarî ya daneyên metabolîtan bi karanîna pakêta nermalava preprocessCore (57) hate kirin.
Amadekirina perçeyan. Mişk bi lez û bez bi karbondîoksîtê hat bêhişkirin û serê wî hat jêkirin, mêjî bi lez ji serê wî hat derxistin, û kêrê lerzok ê bi qeşayê tijîkirî (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Almanya) hat bikaranîn da ku ew bikeve beşên sagîtal ên 300 heta 375 μm. Gazîkirina karbona sar (95% O2 û 5% CO2) Ca2 + ACSF ya kêm (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampona sodyûm fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukoz, 1.0 mM CaCl2 û 6.0 mM MgCl2. PH li gorî 7.4 û 310 heta 330 mOsm were sererast kirin. Perçeyên mêjî yên bidestxistî veguhezînin odeyek ku tê de Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampona sodyûm fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukoz, 4.0 mM CaCl2 û mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 û 310 heta 320 mOsm bilindtir heye. Perçeyan ji bo 20 heta 30 hûrdeman hilînin da ku berî tomarkirinê werin sererast kirin.
tomarkirin. Ji bo hemî tomarkirinan qonaxek mîkroskopê ya bi odeyek tomarkirinê ya sabît û lenzek objektîf a 20x a avê (Scientifica) ve hatî sazkirin hate bikar anîn. Hucreyên Purkinje yên texmînkirî bi (i) mezinahiya laş, (ii) cihê anatomîk ê mejî, û (iii) îfadeya gena raporterê mtYFP ya floresan hatin destnîşankirin. Pîpeta patch bi berxwedana serî ya 5 heta 11 megohms ji hêla kapîlarek cama borosîlîkat (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Almanya) û pîpetek horizontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA ve tê kişandin. Hemî tomarkirin ji hêla amplîfîkatora kelepçeya patch a npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Almanya) ve hatin kirin, ku ji hêla nermalava Signal (guhertoya 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Keyaniya Yekbûyî) ve hate kontrol kirin. Ceribandin bi rêjeya nimûnegirtinê ya 12.5 kHz hate tomar kirin. Sînyal bi du fîlterên Bessel ên derbasbûna kurt bi frekansên qutkirinê yên 1.3 û 10 kHz tê fîltrekirin. Kapasîteya parzûn û pîpetê bi karanîna amplîfîkatorê ji hêla devreya tezmînatê ve tê tezmînkirin. Hemû ceribandin di bin kontrola kamerayek Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Almanya) de hatin kirin, ku ji hêla nermalava Hokawo (guhertoya 2.8, Hamamatsu, Gerden, Almanya) ve dihat kontrolkirin.
Veavakirin û analîza rûtîn a tevahiya şaneyê. Yekser berî tomarkirinê, pîpetê bi çareseriya navxweyî ya ku madeyên jêrîn tê de hene tijî bikin: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potasyûm glukonat, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine trîfosfat (GTP) (Na) û 10.0 mM kreatînîn fosfat li pH 7.25 hatin sererast kirin, û zexta osmotîk 290 mOsm (sukroz) bû. Yekser piştî sepandina hêzek 0 pA ji bo şikandina parzûnê, potansiyela parzûna bêhnvedanê hate pîvandin. Berxwedana ketinê bi sepandina herikên hîperpolarîzekirî yên -40, -30, -20, û -10 pA tê pîvandin. Mezinahiya bersiva voltaja bipîvin û qanûna Ohm bikar bînin da ku berxwedana ketinê hesab bikin. Çalakiya xweber di kelepçeya voltaja de ji bo 5 xulekan hate tomar kirin, û sPSC di Igor Pro (guhertoya 32 7.01, WaveMetrics, Gola Oswego, Oregon, USA) de bi karanîna skrîptek naskirina nîv-otomatîk hate destnîşankirin û pîvandin. Xêza IV û herika rewşa sabît bi girtina pîlê li potansiyelên cûda (ji -110 mV dest pê dike) û zêdekirina voltaja bi gavên 5 mV têne pîvandin. Hilberîna AP bi sepandina herikeke depolarizasyonê hate ceribandin. Dema ku pulseke herika depolarizasyonê tê sepandin, şaneyê li -70 mV kilît bikin. Mezinahiya gavê ya her yekîneya tomarkirinê bi cuda (10 heta 60 pA) rast bikin. Frekansa AP ya herî zêde bi jimartina destan a lûtkeyên pulsê yên ku dibin sedema frekansa AP ya herî bilind hesab bikin. Asta AP bi karanîna derivatîfa duyemîn a pulsa depolarizasyonê ya ku pêşî yek an çend AP-yan çalak dike tê analîz kirin.
Veavakirin û analîzkirina lekeyên qulkirî. Tomarkirina lekeyên qulkirî bi karanîna protokolên standard pêk bînin. Pîpetek bê ATP û GTP bikar bînin ku pêkhateyên jêrîn tê de tune ne: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA û 2 mM MgCl2, û pH-ê li gorî 7.2 (bi karanîna KOH) rast bikin. ATP û GTP ji çareseriya navxaneyî têne derxistin da ku rê li ber permeabilîteya bêkontrol a parzûna şaneyê bigirin. Pîpeta lekeyê bi çareseriyek navxweyî ya ku amfoterîsîn tê de heye (bi qasî 200 heta 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) tê dagirtin da ku tomarê lekeyên qulkirî were bidestxistin. Amfoterîsîn di dîmetîl sulfoksîdê de hate çareser kirin (têkeliya dawî: 0.1 heta 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Têkeliya DMSO-ya ku hatiye bikar anîn bandorek girîng li ser neuronên ku hatine lêkolîn kirin nekir. Di dema pêvajoya qulkirinê de, berxwedana kanalê (Ra) bi berdewamî hate şopandin, û ceribandin piştî ku amplîtuda Ra û AP stabîl bûn (20-40 deqîqe) dest pê kir. Çalakiya xweber di kelepçeya voltaja û/an jî herikê de ji bo 2 heta 5 deqîqeyan tê pîvandin. Analîza daneyan bi karanîna Igor Pro (guhertoya 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (guhertoya 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) û GraphPad Prism (guhertoya 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) hate kirin. Dewletên Yekbûyî yên Amerîkayê). Ji bo destnîşankirina AP-yên xweber, pêveka NeuroMatic v3.0c ya IgorPro tê bikar anîn. Bi karanîna eşikek diyarkirî, ku ji bo her tomarê bi ferdî tê verast kirin, AP-yan bixweber nas bikin. Bi karanîna navbera lûtkeyê, frekansa lûtkeyê bi frekansa lûtkeya herî zêde ya yekser û frekansa lûtkeya navînî diyar bikin.
Îzolekirina PN. Bi adaptekirina protokola berê ya weşandî, PN di qonaxek diyarkirî de ji memikê mişk hate paqijkirin (58). Bi kurtasî, memik di navgîna veqetandina sar de hate parçekirin û hûrkirin [bêyî HBSS Ca2+ û Mg2+, bi 20 mM glukoz, penisîlîn (50 U/ml) û streptomîsîn (0.05 mg/ml) lê hatiye zêdekirin], û dûv re navgîn di papain [HBSS, bi 1-sîsteîn·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) û deoksîrîbonukleaz I (DNase I; 0.1 mg/ml) lê hatiye zêdekirin]. 30 deqîqeyan di 30°C de derman bikin. Pêşî tevnên di navgîna HBSS de ku tê de mukusa hêkê (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) û DNase (0.1 mg/ml) heye, di germahiya odeyê de bişon da ku pêşî li helandina enzîmatîk bigirin, û dû re di navgîna HBSS de ku tê de 20 mM glukoz heye, bi nermî di HBSS, penisîlîn (50 U/ml), streptomîsîn (0.05 mg/ml) û DNase (0.1 mg/ml) de hûr bikin û şaneyên yekane derxînin. Suspensiyona şaneyê ya encam bi rêya parzûnek şaneyê ya 70μm hate parzûnkirin, dû re şane bi santrifujkirinê (1110 rpm, 5 deqe, 4°C) hatin peletkirin û di navgîna rêzkirinê de [HBSS, bi 20 mM glukoz, 20% fetal dewar) Serum, penisîlîn (50 U/ml) û streptomîsîn (0.05 mg/ml)] ji nû ve hatin süspensiyonkirin; jiyanbariya şaneyê bi propidyûm iodîd binirxînin û dendika şaneyê ji 1×106 heta 2×106 şaneyên/ml re rast bikin. Berî sîtometrîya herikînê, suspensiyon bi rêya parzûneke hucreyî ya 50 μm hate parzûnkirin.
Sîtometra herikînê. Cûrkirina şaneyan di 4°C de bi karanîna makîneya FACSAria III (BD Biosciences) û nermalava FACSDiva (BD Biosciences, guhertoya 8.0.1) hate kirin. Suspensiyona şaneyan bi karanîna nozuleke 100 μm di bin zexta 20 psi de bi rêjeya ~2800 bûyer/saniye hate rêzkirin. Ji ber ku pîvanên dergehê yên kevneşopî (mezinahiya şaneyê, cudakirina bimodal, û taybetmendiyên belavbûnê) nikarin veqetandina rast a PN ji celebên din ên şaneyan misoger bikin, stratejiya dergehê li ser bingeha berawirdkirina rasterast a şîdeta YFP û otofluoresansa di mişkên mitoYFP+ ​​​​û kontrol mitoYFP − de tê danîn. YFP bi tîrêjkirina nimûneyê bi xêzek lazer a 488 nm tê teşwîqkirin, û sînyal bi karanîna fîlterek derbasbûna band 530/30 nm tê tespît kirin. Di mişkên mitoYFP+ ​​​​de, hêza nisbî ya gena raportor Rosa26-mitoYFP jî ji bo cûdakirina perçeyên laşê neuronal û axonê tê bikar anîn. 7-AAD bi lazerek zer a 561 nm tê çalakkirin û bi fîlterek derbasbûna bandê ya 675/20 nm tê tespîtkirin da ku şaneyên mirî werin dûrxistin. Ji bo ku di heman demê de astrosît werin veqetandin, rawestandina şaneyê bi ACSA-2-APC hate boyaxkirin, dûv re nimûne bi xêzek lazer a 640 nm hate tîrêjkirin, û fîlterek derbasbûna bandê ya 660/20 nm ji bo tespîtkirina sînyalê hate bikar anîn.
Hucreyên berhevkirî bi santrifujkirinê (1110 rpm, 5 deqe, 4°C) hatin peletkirin û heta bikaranînê di -80°C de hatin hilanîn. Mişkên Mfn2cKO û kûçikên wan ên kovî di heman rojê de têne dabeşkirin da ku guherbariya prosedurî ​​kêm bibe. Pêşkêşkirin û analîza daneyên FACS bi karanîna nermalava FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) hate kirin.
Wekî ku li jor hate gotin (59), PCR-ya demrast ji bo veqetandina DNA-yê ji neuronên rêzkirî ji bo pîvandina mtDNA-yê ya paşê tê bikar anîn. Xêzikbûn û hesasiyeta eşikê di destpêkê de bi xebitandina qPCR-ê li ser hejmarên cûda yên şaneyan hatin ceribandin. Bi kurtasî, 300 PN di tamponek lîzê de ku ji 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 û proteînaz K (200 ng/ml) pêk tê berhev bikin û di 55°C de 120 hûrdeman înkubasyon bikin. Şane ji bo misogerkirina bêçalakkirina tevahî ya proteînaz K 10 hûrdeman di 95°C de hatin înkubasyon kirin. Bi karanîna probeke TaqMan (Thermo Fisher) a taybetî ji bo mt-Nd1, mtDNA bi PCR-ya nîv-hejmarî di pergala PCR-ya Demrast a 7900HT (Thermo Fisher Scientific) de hate pîvandin. Zanist, jimareya katalogê Mm04225274_s1), genên mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, jimareya katalogê AIVI3E8) û genên 18S (Thermo Fisher Scientific, jimareya katalogê Hs99999901_s1).
Amadekirina nimûneya proteomê. Bi germkirina çareseriyê di 95°C de bo 10 deqîqeyan û bi sonîkasyonê, di tampona lîzê de [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide û 100 mM tris-Lyse cemidî neuron pellets in HCl]. Li ser Bioruptor (Diagenode) bo 10 deqîqeyan (30 saniye puls / 30 saniye dema bêhnvedanê). Nimûne di 20 mM tris-HCl (pH 8.0) de bi rêjeya 1:10 hate şilkirin, bi 300 ng trypsin gold (Promega) re hate tevlihevkirin, û şevekê di 37°C de hate înkubasyonkirin da ku bi tevahî were helandin. Di roja duyemîn de, nimûne bo 20 deqîqeyan di 20,000 g de hate santrifujkirin. Supernatant bi 0.1% asîda formîk hate şilkirin, û çareserî bi StageTips-ên xwemalî hatine çêkirin hate bêxwêkirin. Nimûne di amûrek SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) de di 45°C de hate hişk kirin, û dû re peptîd di asîda formîk a 0.1% de hate sekinandin. Hemî nimûne ji hêla heman kesî ve di heman demê de hatin amadekirin. Ji bo analîzkirina nimûneyên astrosîtan, 4 μg peptîdên bêxwê bi etîketek girseyî ya tandem (TMT10plex, hejmara katalogê 90110, Thermo Fisher Scientific) bi rêjeya peptîd ji reaktîfa TMT re ya 1:20 hatin nîşankirin. Ji bo nîşankirina TMT, 0.8 mg reaktîfa TMT di 70 μl ACN-ya bêav de hate ji nû ve sekinandin, û peptîda hişkkirî di 9 μl TEAB-ya 0.1 M (trîetîlammonîûm bîkarbonat) de hate ji nû ve avakirin, ku 7 μl reaktîfa TMT di ACN-ê de lê hate zêdekirin. Têkelbûn %43.75 bû. Piştî 60 hûrdeman înkubasyonê, reaksiyon bi 2 μl hîdroksîlamîn a 5% hate vemirandin. Peptîdên nîşankirî hatin berhevkirin, hişk kirin, di 200μl asîda formîk (FA) ya %0.1 de ji nû ve hatin sekinandin, bûn du parçe, û dûv re bi karanîna StageTips-ên xwemalî hatin bêxwêkirin. Bi karanîna kromatografiya şilava ultra-performansa bilind a UltiMate 3000 (kromatografiya şilava ultra-performansa bilind a UltiMate 3000), yek ji her du nîvan li ser stûnek kromatografiya Acquity ya 1mm x 150mm ku bi perçeyên C18 yên 130Å1.7μm dagirtî bû, hate parçekirin (Waters, Hejmara katalogê SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Peptîdan bi rêjeya herikîna 30μl/min ji hev veqetînin, ji %1 heta %50 tampona B ji bo 85 hûrdeman bi gradyantek gav bi gav a 96 hûrdeman, ji %50 heta %95 tampona B ji bo 3 hûrdeman, dûv re 8 hûrdeman ji bo %95 Tampona B ji hev veqetînin; Tampona A ji %5 ACN û 10 mM bîkarbonata amonyûm (ABC) pêk tê, û tampona B jî ji %80 ACN û 10 mM ABC pêk tê. Her 3 deqîqeyan carekê perçeyan berhev bikin û wan bikin du kom (1 + 17, 2 + 18, hwd.) û di santrifûjeke valahiyê de hişk bikin.
Analîza LC-MS/MS. Ji bo spektrometriya girseyî, peptîd (hejmara r119.aq) li ser stûnek analîtîk a PicoFrit a 25 cm, bi qûtra hundirîn a 75 μm (lenza objektîf a nû, hejmara parçeyê PF7508250) ku bi navgîniya 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ (Dr. Maisch, mat) ve hatî sazkirin, hatin veqetandin, EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Almanya) bikar bînin. Stûn di 50°C de hate parastin. Tamponên A û B bi rêzê ve 0.1% asîda formîk di avê de û 0.1% asîda formîk di 80% ACN de ne. Peptîd ji tampona B ya 6% heta 31% ji bo 65 hûrdeman û ji tampona B ya 31% heta 50% ji bo 5 hûrdeman bi gradientek 200 nl/min hatin veqetandin. Peptîdên elutekirî li ser spektrometreyek girseyî ya Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific) hatin analîz kirin. Pîvandina m/z ya pêşgira peptîdê bi çareseriyek 120,000 di navbera 350 û 1500 m/z de tê kirin. Bi karanîna enerjiya pevçûnê ya normalîzekirî ya 27%, pêşgira herî bihêz bi rewşa barkirinê ya 2 heta 6 ji bo parçekirina veqetandina dafika C ya enerjiya bilind (HCD) tê hilbijartin. Dema çerxê li ser 1 s tê danîn. Nirxa m/z ya perçeya peptîdê di dafika îyonê de bi karanîna hedefa AGC ya herî piçûk a 5×104 û dema herî zêde ya derzîkirinê ya 86 ms hate pîvandin. Piştî perçebûnê, pêşgir ji bo 45 s li ser navnîşa derxistina dînamîk hate danîn. Peptîdên bi TMT-ê nîşankirî li ser stûnek Acclaim PepMap a 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, hejmara katalogê 164942) hatin veqetandin, û spektrumên koçberiyê li ser spektrometreyek girseyî ya Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) ku bi alavên îyonên şêweya pêlê yên asîmetrîk ên zeviya bilind (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) ve hatî çêkirin hatin analîz kirin, ku bi du voltaja tezmînatê ya −50 û −70 V dixebite. MS3 ku li ser bingeha pêşgirê senkronîzasyonê hatî hilbijartin ji bo pîvandina sînyala îyonê ya rapora TMT tê bikar anîn. Veqetandina peptîdê li ser EASY-nLC 1200, bi karanîna elusiyonek gradient a xêzikî ya 90%, bi konsantrasyona tamponê ya 6% heta 31% hate kirin; tampona A 0,1% FA bû, û tampona B 0,1% FA û 80% ACN bû. Stûna analîtîk di 50°C de tê xebitandin. FreeStyle (guhertoya 1.6, Thermo Fisher Scientific) bikar bînin da ku pelê orîjînal li gorî voltaja tezmînatê ya FAIMS parçe bikin.
Nasname û hejmartina proteînê. Bi karanîna motora lêgerînê ya Andromeda ya yekbûyî, daneyên orîjînal bi karanîna guhertoya MaxQuant 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) hatin analîzkirin. Ji bilî rêzikên Cre recombinase û YFP yên ji Aequorea victoria hatine wergirtin, spektrumên perçeyên peptîdê ji bo rêzika kanonîk û rêzika îzoformê ya proteoma referansa mişk (Proteome ID UP000000589, di Gulana 2017an de ji UniProt hatî dakêşandin) hatin lêgerîn. Oksîdasyona metionîn û asetilasyona proteîna N-termînal wekî guhertinên guhêrbar hatin danîn; metîlasyona sîsteîn karbamoîl wekî guhertinên sabît hat danîn. Parametreyên helandinê li ser "taybetmendî" û "trîpsîn/P" hatine danîn. Hejmara herî kêm a peptîd û peptîdên razber ên ku ji bo nasnameya proteînê têne bikar anîn 1 e; hejmara herî kêm a peptîdên bêhempa 0 e. Di bin şert û mercên hevahengiya nexşeya peptîdê de, rêjeya nasnameya proteînê 0.01 bû. Vebijarka "Peptîda Duyemîn" çalak e. Ji bo veguhestina nasnameyên serkeftî di navbera pelên orîjînal ên cuda de, vebijarka "lihevhatina di navbera runan de" bikar bînin. Ji bo hejmartina bê etîket (LFQ) rêjeya herî kêm a LFQ-ê bi jimareya 1 bikar bînin (60). Şîddeta LFQ-ê ji bo herî kêm du nirxên derbasdar di herî kêm yek koma genotîpê de di her xala demê de tê fîltrekirin, û ji belavkirinek normal bi firehiya 0.3 tê derxistin û ber bi jêr ve 1.8 diçe. Platforma hesabkirinê ya Perseus (https://maxquant.net/perseus/) û R (https://r-project.org/) bikar bînin da ku encamên LFQ-ê analîz bikin. Testek t-ya nerm a du-alî ji pakêta nermalava limma ji bo analîza îfadeya cûdahiyê hate bikar anîn (61). Analîza daneyên lêgerînê bi karanîna ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally û pheatmap tê kirin. Daneyên proteomîkê yên li ser bingeha TMT-ê bi karanîna guhertoya MaxQuant 1.6.10.43 hatin analîz kirin. Li daneyên proteomîk ên xav ji databasa proteomîk a mirovan a UniProt bigerin, ku di Îlona 2018an de hatiye dakêşandin. Analîz faktora rastkirina paqijiya îzotopê ya ku ji hêla hilberîner ve hatî peyda kirin vedihewîne. Ji bo analîza îfadeya cûdahiyê limma di R de bikar bînin. Daneyên orîjînal, encamên lêgerîna databasê, û herikîna xebatê û encam ên analîza daneyan hemî di hevpeymaniya ProteomeXchange de bi rêya depoya hevkarê PRIDE bi nasnameya koma daneyan PXD019690 têne hilanîn.
Têbînîyên fonksiyonel analîzê dewlemendtir dikin. Amûra Analîza Rêya Jêhatîbûnê (QIAGEN) ji bo destnîşankirina dewlemendiya şertên têbînîyên fonksiyonel ên koma daneyan di 8 hefteyan de hate bikar anîn (Wêne 1). Bi kurtasî, navnîşa proteîna hejmarî ya ku ji analîza daneyên LC-MS/MS (spektrometriya girseyî ya tandem) hatî bidestxistin bi pîvanên fîlterê yên jêrîn tê bikar anîn: Mus musculus wekî cure û paşxane tê hilbijartin, û kategoriyê nirxa P ya ku ji hêla Benjamini ve ji bo dewlemendkirina 0.05 an kêmtir hatî sererast kirin nîşan dide ku girîng tê hesibandin. Ji bo vê grafîkê, pênc kategoriyên zêde yên jorîn di her komê de li gorî nirxa P ya sererastkirî têne nîşandan. Bi karanîna testa t-ya pirjimar, bi karanîna bernameya zêdekirina xêzikî ya du-qonaxî ya Benjamini, Krieger, û Yekutieli (Q = 5%), analîza îfadeya proteîna dem-kursê li ser namzetên girîng ên ku di her kategoriyê de hatine destnîşankirin tê kirin, û her rêz bi serê xwe tê analîz kirin. Pêdivî bi pejirandina SD-yek domdar tune.
Ji bo ku em encamên vê lêkolînê bi daneyên weşandî re bidin ber hev û diyagrama Venn di Şekil 1 de çêbikin, me navnîşa proteîna hejmarî bi anotasyonên MitoCarta 2.0 (24) re kir yek. Ji bo çêkirina diyagramê, amûra serhêl Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) bikar bînin.
Ji bo agahdariyên berfireh li ser prosedurên îstatîstîkî yên ku ji bo analîza proteomîkê têne bikar anîn, ji kerema xwe li beşa têkildar a Materyal û Rêbazan binêrin. Ji bo hemî ceribandinên din, agahdariyên berfireh dikarin di destana têkildar de werin dîtin. Heger nehatibe diyarkirin, hemî dane wekî navînî ± SEM têne îfade kirin, û hemî analîzên îstatîstîkî bi karanîna nermalava GraphPad Prism 8.1.2 hatine kirin.
Ji bo materyalên pêvek ên vê gotarê, ji kerema xwe li http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 binêrin.
Ev gotareke gihîştina vekirî ye ku li gorî şertên Lîsansa Creative Commons Attribution-Non-Commercial tê belavkirin, ku destûrê dide karanîn, belavkirin û hilberandinê di her medyayê de, heya ku karanîna dawîn ne ji bo berjewendiya bazirganî be û pêşgotin ew be ku xebata orîjînal rast be. Çavkanî.
Têbînî: Em tenê ji we dixwazin ku hûn navnîşana e-nameya xwe bidin da ku kesê ku hûn pêşniyarî rûpelê dikin bizanibe ku hûn dixwazin ew e-nameyê bibînin û ew ne spam e. Em ê tu navnîşanên e-nameyan negirin.
Ev pirs ji bo ceribandina ka hûn mêvan in û pêşîgirtina şandina otomatîkî ya spamê tê bikar anîn.
Ji hêla E. Motori, I. Atanassov, SMV Koçan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analîza proteomîk a neuronên fonksiyonel eşkere kir ku bernameyên metabolîk ji bo pêşîgirtina li dejenerasyona neuro têne çalak kirin.
Ji hêla E. Motori, I. Atanassov, SMV Koçan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analîza proteomîk a neuronên fonksiyonel eşkere kir ku bernameyên metabolîk ji bo pêşîgirtina li dejenerasyona neuro têne çalak kirin.
©2020 Komeleya Amerîkî ji bo Pêşveçûna Zanistê. hemû maf parastî ne. AAAS hevparê HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef û COUNTER e. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.