Spas ji bo serdana Nature.com. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgiriya CSS-ê bi sînor e. Ji bo encamên çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn guhertoyek nûtir a geroka xwe bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê di Internet Explorer-ê de neçalak bikin). Di vê navberê de, ji bo misogerkirina piştgiriya domdar, em malperê bêyî şêwazkirin an JavaScript nîşan didin.
Asîda propîyonîk (PPA) ji bo lêkolîna rola nelirêtiya mîtokondrî di nexweşiyên pêşketina mejî de wekî nexweşiya spektruma otîzmê tê bikar anîn. PPA tê zanîn ku biyogenez, metabolîzm û veguherîna mîtokondrî têk dide. Lêbelê, bandorên PPA li ser dînamîkên mîtokondrî, fîsyon û hevgirtinê ji ber xwezaya demkî ya tevlihev a van mekanîzmayan pirsgirêk dimînin. Li vir, em teknîkên wênekirina hejmarî yên temamker bikar tînin da ku lêkolîn bikin ka PPA çawa bandorê li ultrastruktur, morfolojî û dînamîkên mîtokondrî di hucreyên SH-SY5Y yên mîna neuronê de dike. PPA (5 mM) bû sedema kêmbûnek girîng di qada mîtokondrî (p < 0.01), diametr û dorpêça Feret (p < 0.05), û qada 2 (p < 0.01). Analîza cihê bûyerê mîtokondrî zêdebûnek girîng (p < 0.05) di bûyerên fîsyon û hevgirtinê de nîşan da, bi vî rengî yekparebûna tora mîtokondrî di bin şert û mercên stresê de diparêze. Herwiha, îfadeya mRNA ya cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) û OPA1 (p < 0.05) bi girîngî kêm bû. (01). Ev yek ji nû ve avakirina morfolojiya mîtokondrî, biyogenez û dînamîkên wê nîşan dide da ku fonksiyonê di bin şert û mercên stresê de biparêze. Daneyên me têgihîştinek nû li ser bandorên PPA li ser dînamîkên mîtokondrî peyda dikin û kêrhatîbûna teknîkên wênekirinê ji bo lêkolîna mekanîzmayên rêkûpêk ên tevlihev ên di bersivên stresê yên mîtokondrî de ronî dikin.
Mîtokondrî ji bilî rolên xwe yên tîpîk di hilberîna enerjiyê û bîyosentezê de, di gelek fonksiyonên hucreyî de beşdarên girîng in. Metabolîzma mîtokondrî rêkxerê sereke yê sînyala kalsiyûmê, homeostaza metabolîk û redoks, sînyala înflamatuar, guhertinên epîgenetîk, zêdebûna hucreyan, cûdakirin û mirina hucreya bernamekirî ye1. Bi taybetî, metabolîzma mîtokondrî ji bo pêşveçûn, zindîman û fonksiyonê ya neuronan girîng e û bi berfirehî di xuyangên cûrbecûr ên neuropatolojiyê de cih digire2,3,4.
Di deh salên dawî de, rewşa metabolîk wekî rêkxerê navendî yê neurogenesis, cudabûn, gihîştin û plastîkbûnê derketiye holê5,6. Di demên dawî de, morfolojî û dînamîkên mîtokondrî bûne pêkhateyên girîng ên mîtokondrî, pêvajoyek dînamîk ku hewzek mîtokondriyên saxlem di nav hucreyan de diparêze. Dînamîkên mîtokondrî ji hêla rêyên tevlihev ên girêdayî ve têne rêve kirin ku ji biyogeneza mîtokondrî û biyoenerjiya mîtokondrî bigire heya dabeşkirin, hevgirtin, veguhastin û paqijkirina mîtokondrî7,8. Têkçûna yek ji van mekanîzmayên entegrasyonê parastina torên mîtokondrî yên saxlem xirab dike û encamên fonksiyonel ên kûr ji bo pêşkeftina neuro çêdike9,10. Bi rastî, bêserûberkirina dînamîkên mîtokondrî di gelek nexweşiyên psîkiyatrîk, dejenerasyona neuro û pêşkeftina neuro de, di nav de nexweşiyên spektruma otîzmê (ASD)11,12 de tê dîtin.
ASD nexweşiyeke nehevseng a pêşketina mejî ye ku xwedî mîmariyeke genetîkî û epîgenetîk a tevlihev e. Mîratgiriya ASD nayê înkarkirin, lê etiolojiya molekulî ya bingehîn hîn jî baş nayê famkirin. Daneyên berhevkirî ji modelên pêşklînîkî, lêkolînên klînîkî, û setên daneyên molekulî yên pir-omîk delîlên zêde yên nelirêtiya mîtokondrî di ASD de peyda dikin13,14. Me berê ceribandineke metîlasyona DNA ya li seranserê genomê di komek nexweşên bi ASD de pêk anî û genên bi awayekî cuda metîlkirî yên li ser rêyên metabolîk ên mîtokondrî kom bûne nas kirin15. Piştre me metîlasyona cuda ya rêkxerên navendî yên biyogenez û dînamîkên mîtokondrî ragihand, ku bi zêdebûna hejmara kopiyên mtDNA û guherîna profîla metabolîk a mîzê di ASD16 de ve girêdayî bû. Daneyên me delîlên zêde peyda dikin ku dînamîkên mîtokondrî û homeostaz roleke navendî di patofîzyolojiya ASD de dilîzin. Ji ber vê yekê, baştirkirina têgihîştina mekanîstîk a têkiliya di navbera dînamîkên mîtokondrî, morfolojî û fonksiyonê de armanceke sereke ya lêkolînên berdewam ên li ser nexweşiyên neurolojîk ên ku bi nelirêtiya mîtokondrî ya duyemîn ve têne diyar kirin e.
Teknîkên molekulî pir caran ji bo lêkolîna rola genên taybetî di bersivên stresê yên mîtokondrî de têne bikar anîn. Lêbelê, ev nêzîkatî dibe ku ji hêla xwezaya piralî û demkî ya mekanîzmayên kontrola mîtokondrî ve sînordar be. Wekî din, îfadeya cûda ya genên mîtokondrî nîşanek nerasterast a guhertinên fonksiyonel e, nemaze ji ber ku tenê hejmareke sînorkirî ya genan bi gelemperî têne analîz kirin. Ji ber vê yekê, rêbazên rasterasttir ji bo lêkolîna fonksiyona mîtokondrî û biyoenergetîkê hatine pêşniyar kirin17. Morfolojiya mîtokondrî bi dînamîkên mîtokondrî ve girêdayî ye. Şikl, girêdan û avahiya mîtokondrî ji bo hilberîna enerjiyê û domandina mîtokondrî û hucreyê girîng in5,18. Wekî din, pêkhateyên cihêreng ên mîtozê li ser guhertinên di morfolojiya mîtokondrî de disekinin, ku dikarin wekî xalên dawîn ên bikêrhatî yên nefonksiyona mîtokondrî xizmet bikin û bingehek ji bo lêkolînên mekanîstîk ên paşê peyda bikin.
Morfolojiya mîtokondrî dikare rasterast bi karanîna mîkroskopiya elektrona veguhestinê (TEM) were çavdêrîkirin, ku rê dide lêkolînek berfireh a ultraava hucreyî. TEM rasterast morfolojî, şekil û avahiya krîstayên mîtokondrî di çareseriya mîtokondriyên takekesî de dîtbarî dike, li şûna ku tenê li ser transkrîpsiyona genan, îfadeya proteînê an parametreyên fonksiyonel ên mîtokondrî di nifûsa hucreyan de bisekine17,19,20. Wekî din, TEM lêkolîna têkiliyên di navbera mîtokondrî û organelên din de, wekî retîkuluma endoplazmîk û otofagozoman, ku di fonksiyona mîtokondrî û homeostazê de rolên sereke dilîzin, hêsan dike21,22. Bi vî rengî, ev yek TEM-ê dike xalek destpêkek baş ji bo lêkolîna nefonksiyona mîtokondrî berî ku li ser rê an genên taybetî bisekine. Ji ber ku fonksiyona mîtokondrî bi neuropatolojiyê re her ku diçe girîngtir dibe, hewcedariyek eşkere heye ku meriv bikaribe morfolojî û dînamîkên mîtokondrî rasterast û hejmarî di modelên neuronal ên in vitro de lêkolîn bike.
Di vê gotarê de, em dînamîkên mîtokondrî di modelek neuronal a bêserûberiya mîtokondrî di nexweşiya spektruma otîzmê de vedikolin. Me berê metîlasyona cuda ya propionyl-CoA karboksîlaz beta (PCCB) di ASD15 de, ku yekîneyek enzîma PCC ya propionyl-CoA karboksîlaz a mîtokondrî ye, ragihandibû. Tê zanîn ku bêserûberiya PCC dibe sedema kombûna jehrîn a derivatîfên propionyl, di nav de asîda propîonîk (PPA)23,24,25. Hatiye nîşandan ku PPA metabolîzma neuronal têk dibe û tevgerê di vivo de diguherîne û modelek heywanan a damezrandî ye ji bo lêkolîna mekanîzmayên pêşkeftina neuro yên di ASD de beşdar in26,27,28. Wekî din, hatiye ragihandin ku PPA potansiyela membrana mîtokondrî, biyogenez û nefesê di vitro de têk dibe û bi berfirehî ji bo modelkirina bêserûberiya mîtokondrî di neuronan de hatiye bikar anîn29,30. Lêbelê, bandora bêserûberiya mîtokondrî ya ji hêla PPA ve li ser morfolojî û dînamîkên mîtokondrî hîn jî ne baş tê fam kirin.
Ev lêkolîn teknîkên wênekirina temamker bikar tîne da ku bandorên PPA li ser morfolojî, dînamîk û fonksiyona mîtokondrî di hucreyên SH-SY5Y de bipîve. Pêşî, me rêbazek TEM pêşxist da ku guhertinên di morfolojî û ultraavakirina mîtokondrî de dîtbarî bike17,31,32. Ji ber xwezaya dînamîk a mîtokondrî33, me analîza cihêkirina bûyerên mîtokondrî (MEL) jî bikar anî da ku guhertinên di hevsengiya di navbera bûyerên fîsyon û hevgirtinê, hejmara mîtokondrî û qebareya di bin stresa PPA de bipîve. Di dawiyê de, me lêkolîn kir ka morfolojî û dînamîkên mîtokondrî bi guhertinên di îfadeya genên ku di bîyogenez, fîsyon û hevgirtinê de beşdar in ve girêdayî ne. Bi hev re, daneyên me dijwarîya ronîkirina tevliheviya mekanîzmayên ku dînamîkên mîtokondrî rêk dixin nîşan didin. Em kêrhatîbûna TEM di lêkolîna morfolojiya mîtokondrî de wekî xalek dawîn a pîvandî ya konvergent a mîtokondrî di hucreyên SH-SY5Y de ronî dikin. Wekî din, em destnîşan dikin ku daneyên TEM dema ku bi teknîkên wênekirinê re têne hev kirin ku bûyerên dînamîk jî di bersiva stresa metabolîk de digirin, agahdariya herî dewlemend peyda dikin. Taybetmendiyên bêtir ên mekanîzmayên rêkxistina molekulî yên ku piştgirî didin mîtoza hucreya neuronal, dibe ku têgihiştinek girîng li ser pêkhateya mîtokondrî ya pergala demarî û nexweşiyên neurodejenerasyonê peyda bike.
Ji bo teşhîrkirina stresa mîtokondrî, şaneyên SH-SY5Y bi karanîna PPA-yê bi karanîna 3 mM û 5 mM sodyûm propîonat (NaP) hatin dermankirin. Berî TEM-ê, nimûne bi karanîna cemidandin û cemidandina bi zexta bilind hatin amadekirina nimûneya krîyojenîk (Wêne 1a). Me boriyek analîza wêneya mîtokondrî ya otomatîk pêşxist da ku heşt parametreyên morfolojîk ên nifûsa mîtokondrî li ser sê dubarekirinên biyolojîkî bipîvin. Me dît ku dermankirina PPA çar parametreyan bi girîngî guhertiye: qada 2, qada, perimeter, û diametera Feret (Wêne 1b-e). Qada 2 bi dermankirina PPA ya 3 mM û 5 mM bi girîngî kêm bû (p = 0.0183 û p = 0.002, bi rêzê ve) (Wêne 1b), di heman demê de qada (p = 0.003), perimeter (p = 0.0106) û diametera Feret hemî bi girîngî kêm bûn. Di koma dermankirina 5 mM de li gorî koma kontrolê kêmbûnek girîng (p = 0.0172) hebû (Wêne 1c-e). Kêmkirinên girîng di rûber û dorhêlê de nîşan dan ku şaneyên ku bi 5 mM PPA hatine dermankirin mîtokondriyên piçûktir û girovertir hebûn, û ev mîtokondrî ji yên di şaneyên kontrolê de kêmtir dirêjkirî bûn. Ev yek di heman demê de bi kêmbûnek girîng di qûtra Feret de jî lihevhatî ye, parametreyek serbixwe ku kêmbûna dûrahiya herî mezin di navbera qiraxên perçeyan de nîşan dide. Guhertinên di ultraavakirina krîstayan de hatin dîtin: krîsta di bin bandora stresa PPA de kêmtir diyar bûn (Wêne 1a, panela B). Lêbelê, ne hemî wêne bi zelalî ultraavakirina krîstayan nîşan dan, ji ber vê yekê analîzek hejmarî ya van guhertinan nehat kirin. Ev daneyên TEM dikarin sê senaryoyên gengaz nîşan bidin: (1) PPA fîsyon zêde dike an jî hevgirtinê asteng dike, dibe sedema piçûkbûna mîtokondriyên heyî; (2) biyogeneza zêdekirî mîtokondriyên nû û piçûktir diafirîne an (3) her du mekanîzmayan di heman demê de çalak dike. Her çend ev şert û merc bi TEM nayên cûdakirin jî, guhertinên morfolojîk ên girîng guhertinên di homeostaz û dînamîkên mîtokondriyê de di bin stresa PPA de nîşan didin. Piştre me parametreyên din lêkolîn kirin da ku van dînamîkan û mekanîzmayên potansiyel ên bingehîn ên wan bêtir diyar bikin.
Asîda propîyonîk (PPA) morfolojiya mîtokondrî ji nû ve ava dike. (a) Wêneyên mîkroskopiya elektronê ya veguhestinê ya nûner (TEM) nîşan didin ku mezinahiya mîtokondrî kêm dibe û mîtokondrî bi zêdebûna dermankirina PPA piçûktir û girovertir dibin; bi rêzê ve 0 mM (ne dermankirî), 3 mM û 5 mM. Tîrên sor mîtokondrî nîşan didin. (b–e) Hucreyên SH-SY5Y yên ku bi PPA ji bo 24 demjimêran hatine dermankirin ji bo TEM hatin amadekirin û encam bi karanîna Fiji/ImageJ hatin analîzkirin. Çar ji heşt parametreyan cûdahiyên girîng di navbera hucreyên kontrolê (ne dermankirî, 0 mM PPA) û hucreyên dermankirî (3 mM û 5 mM PPA) de nîşan dan. (b) Herêma 2, (c) Rûber, (d) Perîmetre, (e) Qûtra Feret. Analîza yekalî ya guherînê (kontrol vs. dermankirin) û testa berawirdkirina pirjimar a Dunnett ji bo destnîşankirina cûdahiyên girîng hatin bikar anîn (p < 0.05). Xalên daneyan nirxa navînî ya mîtokondrî ji bo her hucreyek ferdî temsîl dikin, û barên çewtiyê navînî ± SEM temsîl dikin. Daneyên hatine nîşandan n = 3 temsîl dikin, herî kêm 24 hucrey di her dubarekirinê de; bi tevahî 266 wêne hatin analîzkirin; * nîşan dide p < 0.05, ** nîşan dide p < 0.01.
Ji bo ku em bêtir diyar bikin ka dînamîkên mîtokondrî çawa bertek nîşanî PPA didin, me mîtokondrî bi tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) boyax kirin û mîkroskopiya demkî û analîza MEL bikar anîn da ku mîtokondrî piştî 24 demjimêran li 3 û 5 mM PPA cih û hejmar bikin. Dermankirina bûyerên fîsyon û hevgirtinê. (Wêne 2a). Piştî analîza MEL, mîtokondrî bêtir hatin analîz kirin da ku hejmara avahiyên mîtokondrî û qebareya wan a navînî were hejmartin. Me zêdebûnek piçûk lê girîng di hejmara bûyerên fîsyonê de dît ku di 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] de çêdibin li gorî fîsyon [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] û bûyerên fîsyon [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] û fîsyon [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] bûyerên li 5 mM li gorî kontrolê bi girîngî zêde bûn (Wêne 3b). Hejmara mîtokondriyan hem di 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] û hem jî di 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] de bi girîngî zêde bû (Wêne 3c), di heman demê de qebareya navînî ya her avahiya mîtokondriyê bêguherîn ma (Wêne 3c). 3d). Bi hev re, ev yek nîşan dide ku ji nû ve çêkirina dînamîkên mîtokondriyê wekî bersivek tezmînatê kar dike ku bi serkeftî yekparçeyiya tora mîtokondriyê diparêze. Zêdebûna hejmara bûyerên şikestinê li 3 mM PPA nîşan dide ku zêdebûna hejmara mîtokondriyê qismî ji ber şikestina mîtokondriyê ye, lê ji ber ku qebareya navînî ya mîtokondriyê bi bingehîn bêguherîn dimîne, biyogenez wekî bersivek tezmînatê ya zêde nayê red kirin. Lêbelê, ev dane bi avahiyên mîtokondriyê yên piçûktir û gilover ên ku ji hêla TEM ve têne dîtin re lihevhatî ne û her weha guhertinên girîng di dînamîkên mîtokondriyê yên ku ji hêla PPA ve têne çêkirin de nîşan didin.
Asîda propîyonîk (PPA) ji bo parastina yekparçeyiya torê ji nû ve avakirina mîtokondriyal a dînamîk teşwîq dike. Hucreyên SH-SY5Y hatin çandin, bi 3 û 5 mM PPA 24 saetan hatin dermankirin û bi TMRE û Hoechst 33342 hatin boyaxkirin û piştre analîza MEL hat kirin. (a) Wêneyên mîkroskopiya demkî yên nûner ên ku reng û projeksiyonên şîddeta herî zêde ya dualî di dema 2-an (t2) de ji bo her şert û mercî nîşan didin. Herêmên bijartî yên ku di her wêneya dualî de hatine destnîşan kirin têne zêdekirin û di sê çarçoveyên demê yên cûda (t1-t3) de bi 3D têne xuyang kirin da ku dînamîkên di demê re nîşan bidin; bûyerên hevgirtinê bi kesk têne ronî kirin; bûyerên parçebûnê bi kesk têne ronî kirin. Bi sor tê xuyang kirin. (b) Hejmara navînî ya bûyerên dînamîk li gorî şert û mercî. (c) Hejmara navînî ya avahiyên mîtokondriyal li gorî hucreyê. (d) Qebareya navînî (µm3) ya her avahiya mîtokondriyal li gorî hucreyê. Daneyên hatine nîşandan nûnertiya n = 15 hucreyan li gorî koma dermankirinê dikin. Xetên çewtiyê yên hatine nîşandan navînî ± SEM temsîl dikin, xêza pîvanê = 10 μm, * p < 0.05.
Asîda propîyonîk (PPA) dibe sedema tepeserkirina transkrîpsiyonê ya genên bi dînamîkên mîtokondrî ve girêdayî. Hucreyên SH-SY5Y bi 3 û 5 mM PPA ji bo 24 demjimêran hatin dermankirin. Kêmkirina genê ya nisbî bi karanîna RT-qPCR hate kirin û ji bo B2M normalîze bû. Genên biyogeneza mîtokondrî (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 û (d) NFE2L2. Genên fusion û ffisionê yên mîtokondrî (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 û (i) DRP1. Cûdahiyên girîng (p < 0.05) bi karanîna ANOVA-ya yek-alî (kontrol vs. dermankirinê) û testa berawirdkirina pirjimar a Dunnett hatin ceribandin: * nîşan dide p < 0.05, ** nîşan dide p < 0.01, û **** nîşan dide p < 0.0001. Bar îfadeya navînî ± SEM temsîl dikin. Daneyên hatine nîşandan n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), û n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) dubarekirinên biyolojîkî temsîl dikin.
Daneyên ji analîzên TEM û MEL bi hev re nîşan didin ku PPA morfolojî û dînamîkên mîtokondrî diguherîne. Lêbelê, ev teknîkên wênekirinê têgihîştinê nadin mekanîzmayên bingehîn ên ku van pêvajoyan dimeşînin. Ji ber vê yekê, me îfadeya mRNA ya neh rêkxerên sereke yên dînamîkên mîtokondrî, biyogenez û mîtozê di bersiva dermankirina PPA de lêkolîn kir. Me onkogena mîyeloma hucreyê (cMYC), faktora respirasyonê ya navokî (NRF1), faktora transkrîpsiyona mîtokondrî 1 (TFAM), faktora transkrîpsiyonê ya mîna NFE2 BZIP (NFE2L2), proteîna mîna gastrînê 2 (STOML2), atrofiya demarê optîk 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) û proteîna 1 a têkildarî dînamînê (DRP1) piştî 24 demjimêran dermankirinê bi 3 mM û 5 mM PPA pîvand. Me dermankirina bi PPA 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 û p < 0.0001, bi rêzê ve) û 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) dît. (Wêne 3a-c). Kêmbûna derbirîna mRNA bi dozê ve girêdayî bû: derbirîna cMYC, NRF1 û TFAM bi rêzê ve 5.7, 2.6 û 1.9 caran li 3 mM û bi 11.2, 3 û 2.2 caran li 5 mM kêm bû. Berevajî vê, gena bîyogeneza redoks a navendî NFE2L2 di tu konsantrasyona PPA de nehat guhertin, her çend meylek kêmbûna derbirînê ya bi heman rengî ya girêdayî dozê hat dîtin (Wêne 3d).
Me her wiha derbirîna genên klasîk ên ku di rêkxistina fîsyon û hevgirtinê de beşdar in lêkolîn kir. Tê texmînkirin ku STOML2 di hevgirtinê, mîtofajî û bîyogenezê de beşdar e, û derbirîna wê bi girîngî kêm bû (p < 0.0001) bi 3 mM (guherîna 2.4 qat) û 5 mM (guherîna 2.8 qat) PPA (Wêne 1). 3d). Bi heman awayî, derbirîna gena hevgirtinê ya OPA1 di 3 mM (guherîna 1.6 qat) û 5 mM (guherîna 1.9 qat) PPA de kêm bû (p = 0.006 û p = 0.0024, bi rêzê ve) (Wêne 3f). Lêbelê, me di bin stresa PPA ya 24 demjimêran de cûdahiyên girîng di derbirîna genên hevgirtinê MFN1, MFN2 an gena hevgirtinê DRP1 de nedît (Wêne 3g–i). Herwiha, me dît ku asta çar proteînên fusion û fission (OPA1, MFN1, MFN2 û DRP1) di heman şert û mercan de neguheriye (Wêne 4a-d). Girîng e ku were zanîn ku ev dane xalek yekane di demê de nîşan didin û dibe ku guhertinên di derbirîna proteînê an asta çalakiyê de di qonaxên destpêkê yên stresa PPA de nîşan nedin. Lêbelê, kêmbûnên girîng di derbirîna cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, û OPA1 de nîşana neregulasyona transkrîpsiyonê ya girîng a metabolîzma mîtokondrî, biyogenez û dînamîkên wê ne. Wekî din, ev dane kêrhatîbûna teknîkên wênekirinê ji bo lêkolîna rasterast a guhertinên rewşa dawîn di fonksiyona mîtokondrî de ronî dikin.
Asta proteîna hevgirtin û faktora parçebûnê piştî dermankirina asîda propîyonîk (PPA) neguherî. Hucreyên SH-SY5Y bi 3 û 5 mM PPA ji bo 24 demjimêran hatin dermankirin. Asta proteînê bi analîza Western blot hate hejmartin, û astên îfadeyê li gorî proteîna giştî hatin normalîzekirin. Îfadeya navînî ya proteînê û blotên Western ên nûner ên proteîna hedef û tevahî têne nîşandan. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Bar navînî ± SEM temsîl dikin, û daneyên hatine nîşandan nûnertiya n = 3 dubarekirinên biyolojîkî dikin. Berawirdkirinên pirjimar (p < 0.05) bi karanîna analîza yekalî ya guherînê û testa Dunnett hatin kirin. Jel û blota orîjînal di Wêneya S1 de têne nîşandan.
Nelirêtiya mîtokondrî bi nexweşiyên pirsîstemî ve girêdayî ye, ji nexweşiyên metabolîk, kardiovaskuler û masûlkeyan bigire heya nexweşiyên neurolojîk1,10. Gelek nexweşiyên dejenerasyona mejî û dejenerasyona mejî bi nelirêtiya mîtokondrî ve girêdayî ne, ku girîngiya van organelan di tevahiya jiyana mêjî de destnîşan dike. Van nexweşiyan nexweşiya Parkinson, nexweşiya Alzheimer û ASD3,4,18 vedihewîne. Lêbelê, gihîştina tevnên mêjî ji bo lêkolîna van nexweşiyan dijwar e, nemaze di asta mekanîstîk de, ku pergalên modela hucreyî dike alternatîfek pêdivî. Di vê lêkolînê de, em pergalek modela hucreyî bikar tînin ku hucreyên SH-SY5Y yên bi PPA-yê hatine dermankirin bikar tînin da ku nelirêtiya mîtokondrî ya ku di nexweşiyên neuronal de, nemaze nexweşiyên spektruma otîzmê de tê dîtin, ji nû ve binirxînin. Bikaranîna vê modela PPA ji bo lêkolîna dînamîkên mîtokondrî di neuronan de dibe ku têgihîştinek li ser etiolojiya ASD peyda bike.
Me îhtîmala bikaranîna TEM ji bo dîtina guhertinên di morfolojiya mîtokondrî de lêkolîn kir. Girîng e ku were zanîn ku divê TEM bi awayekî rast were bikar anîn da ku bandora wê herî zêde bibe. Amadekirina nimûneyên krîyo dihêle ku avahiyên neuronal bi hevdemî rastkirina pêkhateyên hucreyî û kêmkirina çêbûna artefaktan çêtir werin parastin34. Li gorî vê yekê, me dît ku hucreyên SH-SY5Y yên mîna neuron organelên jêrhucreyî yên bêkêmasî û mîtokondriyên dirêjkirî hebûn (Wêne 1a). Ev yek kêrhatîbûna teknîkên amadekirina krîyojenîk ji bo lêkolîna morfolojiya mîtokondrî di modelên hucreyên neuronal de ronî dike. Her çend pîvandinên hejmarî ji bo analîza objektîf a daneyên TEM girîng in jî, hîn jî lihevkirinek li ser kîjan parametreyên taybetî divê werin pîvandin da ku guhertinên morfolojîk ên mîtokondrî piştrast bikin tune. Li ser bingeha hejmareke mezin ji lêkolînên ku morfolojiya mîtokondrî bi awayekî hejmarî lêkolîn kirine17,31,32, me boriyek analîza wêneya mîtokondrî ya otomatîk pêşxist ku heşt parametreyên morfolojîk dipîve, ango: rûber, rûber2, rêjeya aliyan, perimeter, dorhêlî, pile , diametera Feret û dorfirehî.
Di nav wan de, PPA rûbera 2, rûber, perimeter, û qûtra Feret bi girîngî kêm kir (Wêne 1b-e). Ev nîşan da ku mîtokondrî piçûktir û girovertir bûne, ku ev yek bi lêkolînên berê re lihevhatî ye ku piştî 72 demjimêran stresa mîtokondrî ya ji hêla PPA30 ve hatî çêkirin, kêmbûna rûbera mîtokondrî nîşan didin. Ev taybetmendiyên morfolojîk dikarin nîşan bidin ku dabeşbûna mîtokondrî, pêvajoyek pêwîst e ku pêkhateyên zirardar ji tora mîtokondrî veqetîne da ku hilweşîna wan bi rêya mîtofajiyê pêşve bibe35,36,37. Ji hêla din ve, kêmbûna mezinahiya navînî ya mîtokondrî dibe ku bi zêdebûna biyogenezê ve girêdayî be, ku dibe sedema çêbûna mîtokondriyên piçûk ên nû. Zêdebûna dabeşbûn an biyogenezê bersivek tezmînatê temsîl dike da ku mîtozê li dijî stresa mîtokondrî biparêze. Lêbelê, kêmbûna mezinbûna mîtokondrî, têkçûna hevgirtinê, an şert û mercên din nayên derxistin.
Her çend wêneyên bi çareseriya bilind ên ku ji hêla TEM ve têne çêkirin rê didin diyarkirina taybetmendiyên morfolojîk di asta mîtokondriyên takekesî de, ev rêbaz di yek xalê de wêneyên du-alî çêdike. Ji bo lêkolîna bersivên dînamîk ên li hember stresa metabolîk, me mîtokondrî bi TMRE boyax kir û mîkroskopiya demkî bi analîza MEL bikar anî, ku destûrê dide dîtbarîkirina 3D ya bi rêjeya bilind a guhertinên di tora mîtokondrî de di demê re33,38. Me di bin stresa PPA de guhertinên nazik lê girîng di dînamîkên mîtokondrî de dîtin (Wêne 2). Li 3 mM, hejmara bûyerên şikestinê bi girîngî zêde bû, lê bûyerên hevgirtinê wekî yên kontrolê man. Zêdebûnek di hejmara hem bûyerên şikestinê û hem jî yên hevgirtinê de li 5 mM PPA hate dîtin, lê ev guhertin bi qasî rêjeyî bûn, ku pêşniyar dike ku kînetîkên şikestinê û hevgirtinê di konsantrasyonên bilindtir de digihîjin hevsengiyê (Wêne 2b). Qebareya navînî ya mîtokondrî di hem 3 û hem jî 5 mM PPA de neguherî ma, ku nîşan dide ku yekparçeyiya tora mîtokondrî hatiye parastin (Wêne 2d). Ev şiyana torên mîtokondrî yên dînamîk nîşan dide ku bersivê bidin stresa metabolîk a sivik da ku bi bandor homeostazê biparêzin bêyî ku perçebûna torê çêbibe. Di 3 mM PPA de, zêdebûna fîsyonê têrê dike ku veguherîna ber bi hevsengiyek nû ve pêşve bibe, lê ji bo bersiva stresa ku ji ber rêjeyên bilindtir ên PPA çêdibe, ji nû ve avakirina kînetîk a kûrtir hewce ye.
Hejmara mîtokondriyan di her du konsantrasyonên stresa PPA de zêde bû, lê qebareya mîtokondriyê ya navînî bi girîngî neguherî (Wêne 2c). Ev dibe ku ji ber zêdebûna biyogenezê an zêdebûna dabeşbûnê be; lêbelê, di nebûna kêmbûnek girîng a qebareya mîtokondriyê ya navînî de, îhtîmalek mezintir heye ku biyosentez zêde bibe. Lêbelê, daneyên di Wêne 2 de hebûna du mekanîzmayên tezmînatê piştgirî dikin: zêdebûna hejmara bûyerên şikestinê, ku bi zêdebûna şikestina mîtokondriyê re lihevhatî ye, û zêdebûna hejmara bûyeran, ku bi biyogeneza mîtokondriyê re lihevhatî ye. Di dawiyê de, tezmînata dînamîk ji bo stresa sivik dikare ji pêvajoyên hevdem ên ku şikestin, hevgirtin, biyogenez û mîtofajiyê vedihewîne pêk were. Her çend nivîskarên berê nîşan dane ku PPA mîtozê30,39 û mîtofajiyê29 zêde dike, em delîlan ji bo ji nû ve çêkirina dînamîkên şikestina mîtokondriyê û hevgirtinê di bersiva PPA de peyda dikin. Ev dane guhertinên morfolojîk ên ku ji hêla TEM ve têne dîtin piştrast dikin û têgihîştinek bêtir li ser mekanîzmayên ku bi nefonksiyona mîtokondriyê ya ji hêla PPA ve têne ve girêdayî ne peyda dikin.
Ji ber ku ne analîza TEM û ne jî analîza MEL delîlên rasterast ên mekanîzmayên rêkxistina genan ên di bin guhertinên morfolojîk ên çavdêrîkirî de peyda nekirin, me îfadeya RNA ya genên ku di metabolîzma mîtokondrî, biyogenez û dînamîkên mîtokondrî de beşdar in lêkolîn kir. Proto-onkogena cMYC faktorek transkrîpsiyonê ye ku di rêkxistina mîtokondrî, glîkolîz, metabolîzma asîdên amînî û asîdên rûn de beşdar e40. Wekî din, tê zanîn ku cMYC îfadeya nêzîkî 600 genên mîtokondrî yên ku di transkrîpsiyon, werger û kombûna kompleks a mîtokondrî de beşdar in, di nav de NRF1 û TFAM41, rêk dixe. NRF1 û TFAM du rêkxerên navendî yên mîtozê ne, ku li jêr PGC-1α tevdigerin da ku dubarekirina mtDNA çalak bikin. Ev rê ji hêla sînyala cAMP û AMPK ve tê çalak kirin û ji bo xerckirina enerjiyê û stresa metabolîk hesas e. Me her weha NFE2L2, rêkxerê redoks ê biyogeneza mîtokondrî, lêkolîn kir da ku diyar bikin ka bandorên PPA dibe ku ji hêla stresa oksîdatîf ve werin navbeynkar kirin.
Her çend îfadeya NFE2L2 bêguher ma jî, me piştî 24 demjimêran dermankirinê bi 3 mM û 5 mM PPA kêmbûnek domdar a girêdayî dozê di îfadeya cMYC, NRF1 û TFAM de dît (Wêne 3a-c). Kêmkirina îfadeya cMYC berê wekî bersivek ji bo stresa mîtokondrî hatiye ragihandin42, û berevajî vê, kêmkirina îfadeya cMYC dikare bi nûvekirina metabolîzma mîtokondrî, girêdana torê û polarîzasyona membranê bibe sedema nelirêtiya mîtokondrî43. Bi balkêşî, cMYC di rêkxistina dabeşkirin û hevgirtina mîtokondrî de jî beşdar e42,43 û tê zanîn ku fosforîlasyona DRP1 û cihê mîtokondrî di dema dabeşbûna hucreyê de zêde dike44, û her weha navbeynkariya nûvekirina morfolojîk a mîtokondrî di hucreyên stûna neuronal de dike45. Bi rastî, fîbroblastên kêmasiya cMYC mezinahiya mîtokondrî ya kêmkirî nîşan didin, ku lihevhatî ye bi guhertinên ku ji hêla stresa PPA43 ve têne çêkirin. Ev dane têkiliyek balkêş lê hîn nezelal di navbera cMYC û dînamîkên mîtokondrî de nîşan didin, ku armancek balkêş ji bo lêkolînên pêşerojê yên nûvekirina ji ber stresa PPA peyda dike.
Kêmkirina NRF1 û TFAM bi rola cMYC wekî çalakkerek transkrîpsiyonê ya girîng re lihevhatî ye. Ev dane her wiha lihevhatî ne bi lêkolînên berê yên li ser hucreyên kansera kolonê ya mirovan re ku nîşan didin ku PPA di 22 demjimêran de îfadeya mRNA ya NRF1 kêm kiriye, ku bi kêmbûna ATP û zêdebûna ROS46 ve girêdayî bû. Van nivîskaran her wiha ragihandin ku îfadeya TFAM di 8.5 demjimêran de zêde bûye lê di 22 demjimêran de vegeriyaye asta bingehîn. Berevajî vê, Kim et al. (2019) nîşan da ku îfadeya mRNA ya TFAM piştî 4 demjimêran stresa PPA di hucreyên SH-SY5Y de bi girîngî kêm bûye; lêbelê, piştî 72 demjimêran, îfadeya proteîna TFAM bi girîngî zêde bûye û hejmara kopiyên mtDNA bi girîngî zêde bûye. Bi vî rengî, kêmbûna hejmara genên biyogeneza mîtokondrî ku me piştî 24 demjimêran dît, îhtîmala ku zêdebûna hejmara mîtokondrî bi çalakkirina biyogenezê di demên berê de ve girêdayî be, ji holê ranake. Lêkolînên berê nîşan dane ku PPA mRNA û proteîna PGC-1α di hucreyên SH-SY5Y de di 4 saet û 30 deqîqeyan de bi girîngî zêde dike, di heman demê de asîda propîonîk biyogeneza mîtokondrî di hepatosîtên golikan de bi rêya PGC-1α di 12 saet û 39 deqîqeyan de zêde dike. Bi balkêşî, PGC-1α ne tenê rêkûpêkek transkrîpsiyonê ya rasterast a NRF1 û TFAM e, lê di heman demê de hatiye nîşandan ku çalakiya MFN2 û DRP1 bi rêkxistina dabeşkirin û hevgirtinê rêk dixe47. Bi hev re, ev girêdana nêzîk a mekanîzmayên ku bersivên tezmînatê yên mîtokondrî yên ji hêla PPA ve têne çêkirin rêk dixin ronî dike. Wekî din, daneyên me bêserûberiya girîng a rêziknameya transkrîpsiyonê ya biyogenez û metabolîzmê di bin stresa PPA de nîşan didin.
Genên STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 û DRP1 di nav rêkxerên navendî yên dabeşbûn, hevgirtin û dînamîkên mîtokondrî de ne37,48,49. Gelek genên din jî hene ku di dînamîkên mîtokondrî de beşdar in, lêbelê, berê hatiye dîtin ku STOML2, OPA1 û MFN2 di komên ASD de bi awayekî cûda metilkirî ne,16 û çend lêkolînên serbixwe guhertinên di van faktorên transkrîpsiyonê de di bersiva stresa mîtokondrî de ragihandine50,51. 52. Derbirîna hem OPA1 û hem jî STOML2 bi dermankirina 3 mM û 5 mM PPA bi girîngî kêm bû (Wêne 3e, f). OPA1 yek ji rêkxerên klasîk ên hevgirtina mîtokondrî ye bi rêya têkiliya rasterast bi MFN1 û 2 re û rolek di nûvekirina krîsta û morfolojiya mîtokondrî de dilîze53. Rola rastîn a STOML2 di dînamîkên mîtokondrî de ne diyar e, lê delîl nîşan didin ku ew di hevgirtina mîtokondrî, biyogenez û mîtofajiyê de rolek dilîze.
STOML2 di parastina girêdana respirasyonê ya mîtokondrî û avakirina kompleksên zincîra respirasyonê de beşdar e54,55 û hatiye nîşandan ku taybetmendiyên metabolîk ên hucreyên penceşêrê bi awayekî kûr diguherîne56. Lêkolînan nîşan dane ku STOML2 potansiyela membrana mîtokondrî û biyogenezê bi rêya têkiliya bi BAN û kardiolipîn re pêş dixe55, 57, 58. Wekî din, lêkolînên serbixwe nîşan dane ku têkiliya di navbera STOML2 û PINK1 de mîtofajiyê rêk dixe59,60. Bi taybetî, hatiye ragihandin ku STOML2 rasterast bi MFN2 re têkilî datîne û wê stabîl dike û di heman demê de rolek girîng di stabîlkirina îzoformên dirêj ên OPA1 de dilîze bi astengkirina proteaza berpirsiyar a hilweşîna OPA153,61,62. Kêmkirina îfadeya STOML2 ku di reaksiyonên PPA de tê dîtin dibe ku van proteînên hevgirtinê ji bo hilweşînê bi rêya rêyên girêdayî ubîkwîtîn û proteazomê hesastir bike48. Her çend rola rastîn a STOML2 û OPA1 di bersiva dînamîk a li hember PPA de ne diyar be jî, kêmbûna derbirîna van genên hevgirtinê (Wêne 3) dibe ku hevsengiya di navbera fîsyon û hevgirtinê de têk bibe û bibe sedema kêmbûna mezinahiya mîtokondriyê (Wêne 3). 1).
Ji aliyekî din ve, derbirîna proteîna OPA1 piştî 24 demjimêran bêguher ma, di heman demê de asta mRNA û proteîna MFN1, MFN2 an DRP1 piştî dermankirina PPA bi girîngî neguherî (Wêne 3g-i, Wêne 4). Ev dibe ku nîşan bide ku di rêkxistina van faktorên ku di hevgirtin û parçebûna mîtokondrî de beşdar in de ti guhertin tune. Lêbelê, hêjayî gotinê ye ku her yek ji van çar genan jî ji hêla guhertinên piştî transkrîpsiyonê (PTM) ve têne rêkxistin ku çalakiya proteînê kontrol dikin. OPA1 heşt guhertoyên splice yên alternatîf hene ku di mîtokondrî de bi awayekî proteolîtîk têne perçekirin da ku du îzoformên cihêreng hilberînin 63. Hevsengiya di navbera îzoformên dirêj û kurt de di dawiyê de rola OPA1 di hevgirtina mîtokondrî û parastina tora mîtokondrî de diyar dike 64. Çalakiya DRP1 ji hêla fosforîlasyona proteîn kînaz II (CaMKII) ya girêdayî kalsiyûm/kalmodulînê ve tê rêkxistin, di heman demê de hilweşîna DRP1 ji hêla ubîkwîtînasyon û SUMOîlasyonê ve tê rêkxistin 65. Di dawiyê de, hem DRP1 û hem jî MFN1/2 GTPazan in, ji ber vê yekê çalakî dibe ku ji hêla rêjeya hilberîna GTP-ê di mîtokondriyê de bandor bibe 66. Ji ber vê yekê, her çend îfadeya van proteînan sabît bimîne jî, ev dibe ku çalakiya proteînê ya neguherî an jî cihgirbûnê nîşan nede 67,68. Bi rastî, repertuwarên proteîna PTM-ê yên heyî pir caran wekî xeta yekem a parastinê kar dikin ku berpirsiyarê navbeynkariya bersivên stresê yên akût in. Di hebûna stresa metabolîk a nerm de di modela me de, îhtîmal e ku PTM çalakiya zêde ya proteînên fusion û fission pêşve dixe da ku yekparebûna mîtokondriyê bi têra xwe sererast bike bêyî ku hewcedariya çalakkirina zêde ya van genan di asta mRNA an proteînê de hebe.
Bi hev re, daneyên jorîn rêziknameya tevlihev û dem-girêdayî ya morfolojiya mîtokondrî û dijwarîyên ronîkirina van mekanîzmayan ronî dikin. Ji bo lêkolîna îfadeya genan, pêşî pêdivî ye ku genên hedef ên taybetî di rê de werin destnîşankirin. Lêbelê, daneyên me nîşan didin ku genên di heman rêyê de bi heman awayî bersiva heman stresê nadin. Bi rastî, lêkolînên berê nîşan dane ku genên cûda di heman rêyê de dikarin profîlên bersivên demkî yên cûda nîşan bidin30,46. Wekî din, mekanîzmayên tevlihev ên piştî-veguheztinê hene ku têkiliya di navbera veguheztin û fonksiyona genan de têk dibin. Lêkolînên proteomîk dikarin têgihîştinê li ser bandora PTM û fonksiyona proteînê peyda bikin, lê ew di heman demê de dijwarîyan jî derdixin holê, di nav de rêbazên kêm-derbasbûnê, rêjeyên bilind ên sînyalê-deng, û çareseriya xirab.
Di vê çarçoveyê de, lêkolîna morfolojiya mîtokondrî bi karanîna TEM û MEL xwedî potansiyeleke mezin e ji bo çareserkirina pirsên bingehîn ên di derbarê têkiliya di navbera dînamîk û fonksiyonên mîtokondrî de û ka ev çawa bandorê li nexweşiyê dike. Ya herî girîng, TEM rêbazek rasterast peyda dike ji bo pîvandina morfolojiya mîtokondrî wekî xalek dawî ya hevgirtî ya nelirêtiya mîtokondrî û dînamîkan51. MEL di heman demê de rêbazek rasterast peyda dike ji bo dîtbarîkirina bûyerên fîsyon û hevgirtinê di hawîrdorek hucreyî ya sê-alî de, ku destûrê dide hejmartina ji nû ve avakirina mîtokondrî ya dînamîk tewra di nebûna guhertinên di îfadeya genê de33. Li vir em kêrhatîbûna teknîkên wênekirina mîtokondrî di nexweşiyên mîtokondrî yên duyemîn de ronî dikin. Ev nexweşî bi gelemperî bi stresa metabolîk a sivik a kronîk têne xuyang kirin ku bi ji nû ve avakirina nazik a torên mîtokondrî ve têne xuyang kirin ne ku zirara mîtokondrî ya akût. Lêbelê, tezmînata mîtokondrî ya ku ji bo domandina mîtokondrî di bin stresa kronîk de hewce ye encamên fonksiyonel ên kûr hene. Di çarçoveya neurozanistî de, têgihîştinek çêtir a van mekanîzmayên tezmînatê dikare agahdariya girîng di derbarê neuropatolojiya pleiotropîk a bi nelirêtiya mîtokondrî ve girêdayî peyda bike.
Di dawiyê de, daneyên me kêrhatîbûna teknîkên wênekirinê ji bo têgihîştina encamên fonksiyonel ên têkiliyên tevlihev ên di navbera îfadeya genan, guhertinên proteîn û çalakiya proteînê de ku dînamîkên mîtokondrî yên neuronal kontrol dikin, destnîşan dikin. Me PPA bikar anî da ku nelirêtiya mîtokondrî di modelek hucreya neuronal de model bikin da ku têgihîştinek li ser pêkhateya mîtokondrî ya ASD bi dest bixin. Hucreyên SH-SY5Y yên ku bi PPA hatine dermankirin guhertinên di morfolojiya mîtokondrî de nîşan dan: mîtokondrî piçûk û gilover bûn, û krîsta dema ku ji hêla TEM ve hatin dîtin nebaş hatin destnîşankirin. Analîza MEL nîşan dide ku ev guhertin bi hev re bi zêdebûna bûyerên fîsyon û hevgirtinê re çêdibin da ku tora mîtokondrî di bersiva stresa metabolîk a sivik de biparêzin. Wekî din, PPA bi girîngî rêziknameya transkrîpsiyonê ya metabolîzma mîtokondrî û homeostazê têk dide. Me cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, û OPA1 wekî rêkxerên sereke yên mîtokondrî yên ku ji hêla stresa PPA ve hatine têkbirin destnîşan kirin û dibe ku di navbeynkariya guhertinên ku ji hêla PPA ve di morfolojî û fonksiyona mîtokondrî de têne çêkirin de rolek bilîzin. Lêkolînên pêşerojê hewce ne ku guhertinên demkî yên ku ji hêla PPA ve di îfadeya genan û çalakiya proteînê, cihgirtin û guhertinên piştî-wergerandinê de çêtir werin destnîşankirin. Agahiyên me tevlihevî û girêdana hevbeş a mekanîzmayên rêkûpêk ên ku bersiva stresê ya mîtokondrî navbeynkariyê dikin ronî dikin û kêrhatîbûna TEM û teknîkên din ên wênekirinê ji bo lêkolînên mekanîstîk ên armanckirîtir nîşan didin.
Xeta şaneyên SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) ji Sigma-Aldrich hat kirîn. Şaneyên SH-SY5Y di nav tevliheviya xurek a Dulbecco ya guhertî ya medium Eagle/F-12 (DMEM/F-12) û L-glutamine (SC09411, ScienCell) de di şûşeyên 25 cm2 de ku bi 20% seruma fetal a ga (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) û 1% penisîlîn-streptomîsîn (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) li 37°C, 5% CO2 hatine zêdekirin, di 37°C, 5% CO2 de hatin mezin kirin. Şane bi karanîna 0.05% trîpsîn-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) heta 80% hevgirtinê hatin binavkirin, di 300 g de hatin santrifûjkirin û bi dendika nêzîkî 7 × 105 şane/ml hatin plakekirin. Hemû ceribandin li ser şaneyên SH-SY5Y yên ne cuda di navbera pasajên 19-22 de hatin kirin. PPA wekî NaP tê dayîn. Toza NaP (CAS No. 137-40-6, formula kîmyewî C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) di ava germ a MilliQ de heta 1 M konsantrasyonê bihelînin û li 4 °C hilînin. Di roja dermankirinê de, vê çareseriyê bi 1 M PPA heta 3 mM û 5 mM PPA di navgînek bê serum de (DMEM/F-12 bi L-glutamine) têkel bikin. Konsantrasyonên dermankirinê ji bo hemû ceribandinan bê PPA (0 mM, kontrol), 3 mM, û 5 mM PPA bûn. Ceribandin di herî kêm sê dubarekirinên biyolojîkî de hatin kirin.
Hucreyên SH-SY5Y bi rêjeya 5.5 × 105 hucre/ml di nav şûşeyên 25 cm5 de hatin çandin û 24 saetan hatin mezin kirin. Dermankirina PPA berî 24 saetan a înkubasyonê li şûşeyê hat zêdekirin. Peletên hucreyan bi rêbaza protokolên binçandina tevna memikan ên normal (yên ku li jor hatine vegotin) berhev bikin. Peletê hucreyan di 100 µl 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS de ji nû ve bihelînin û heta pêvajoyê di 4°C de hilînin. Hucreyên SH-SY5Y ji bo demek kurt hatin santrifujkirin da ku hucrey werin pelet kirin û çareseriya 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS were rakirin. Sediment di jelek agarozê ya 4% de ku di ava distîlkirî de hatiye amadekirin ji nû ve bihelînin (rêjeya agarozê bi qebareya sedimentê 1:1 e). Parçeyên agarozê li ser torên li ser plakayên daîre hatin danîn û berî cemidandina bi zexta bilind bi 1-heksadecen hatin pêçandin. Nimûne di 100% asetonê hişk de di -90°C de ji bo 24 saetan hatin cemidandin. Paşê germahî heta -80°C hate bilindkirin û çareseriyek ji %1 osmium tetroksît û %0.1 glutaraldehîd hate zêdekirin. Nimûne 24 saetan di -80°C de hatin hilanîn. Piştî vê yekê, germahî di nav çend rojan de hêdî hêdî gihîşt germahiya odeyê: ji -80°C heta -50°C ji bo 24 saetan, heta -30°C ji bo 24 saetan, heta -10°C ji bo 24 saetan û di dawiyê de heta germahiya odeyê.
Piştî amadekirina krîyojenîk, nimûne bi rezînê hatin dagirtin û beşên pir zirav (~100 nm) bi karanîna ultramîkrotomek Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems) hatin çêkirin. Beş bi 2% uranyl asetat û sîtrat serşokê hatin boyaxkirin. Nimûne bi karanîna mîkroskopa elektronîkî ya veguhestinê ya FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (berê FEI), Eindhoven, Hollanda) ku li 200 kV dixebite (veguhêzkarê Lab6) û kamerayek CCD ya Gatan (Gatan, Keyaniya Yekbûyî) ku bi fîlterek enerjiyê ya Tridiem ve hatî sazkirin, hatin çavdêrîkirin.
Di her dubarekirina teknîkî de, herî kêm 24 wêneyên şaneyên yekane hatin bidestxistin, bi tevahî 266 wêne. Hemû wêne bi karanîna makroya Herêma Berjewendiyê (ROI) û makroya Mîtokondriyê hatin analîzkirin. Makroya mîtokondriyê li ser rêbazên weşandî17,31,32 hatiye avakirin û destûrê dide pêvajoya nîv-otomatîk a wêneyên TEM li Fiji/ImageJ69. Bi kurtasî: wêne bi karanîna jêkirina paşxaneya topa gerok (radyusa 60 pixel) û fîlterek derbasbûna bandê ya FFT (bi rêzê ve sînorên jorîn û jêrîn ên 60 û 8 pixel bikar tîne) û tepeserkirina xeta vertîkal bi toleransa arasteyê ya 5% tê berevajîkirin û berevajîkirin. Wêneya pêvajoyî bi karanîna algorîtmayek entropiya herî zêde bixweber tê sînorkirin û maskek dualî tê çêkirin. Herêmên wêneyê yên bi ROI-yên bi destan hatine hilbijartin di wêneyên TEM ên xav de hatine derxistin, mîtokondriyê diyar dikin û membrana plazmayê û herêmên din ên berevajî yên bilind derdixin. Ji bo her ROI-ya derxistî, perçeyên dualî yên ji 600 pîkselan mezintir hatin analîzkirin, û qada perçeyan, perimeter, eksên sereke û piçûk, qûtra Feret, giloverî, û dorhêlî bi karanîna fonksiyonên pîvandinê yên çêkirî yên Fiji/ImageJ hatin pîvandin. Li gorî Merrill, Flippo, û Strack (2017), qada 2, rêjeya aliyê perçeyan (rêjeya eksên sereke berbi eksên piçûk), û faktora şeklê (FF) ji van daneyan hatin hesabkirin, ku FF = perimeter 2/4pi x qada. Pênasîna formula parametrîk dikare di Merrill, Flippo, û Strack (2017) de were dîtin. Makroyên ku hatine behs kirin li ser GitHub-ê hene (li Daxuyaniya Berdestbûna Daneyan binêre). Bi navînî, bi qasî 5,600 perçe ji bo her dermankirina PPA-yê hatin analîzkirin, ji bo bi tevahî bi qasî 17,000 perçeyan (dane nehatine nîşandan).
Hucreyên SH-SH5Y di nav tasên çandiniyê yên 8-odeyî (ThermoFisher, #155411) de hatin danîn da ku şevekê pêve bibin û dûv re bi boyaxkirina TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) û Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) hatin înkubasyonkirin. Wêne bi karanîna lazerên 405 nm û 561 nm di hawîrdorek 10 hûrdemî de hatin bidestxistin, û wêneyên xav wekî z-stacks hatin bidestxistin ku 10 mîkrografên wêneyan bi gava az ya 0.2 μm di navbera çarçoveyên wêneyan de di 12 xalên demê yên li pey hev de dihewîne. Wêne bi karanîna platformek çareseriya super a Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Almanya) bi karanîna lenzek LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 hatin berhevkirin. Wêne di ImageJ de bi karanîna boriyek ku berê hatiye vegotin û pêveka ImageJ hatin analîzkirin da ku bûyerên hevgirtin û parçebûnê, hejmara navînî ya avahiyên mîtokondrî, û qebareya navînî ya mîtokondrî li ser şaneyê bipîvin33. Makroyên MEL li ser GitHub-ê hene (li Daxuyaniya Berdestbûna Daneyan binêre).
Hucreyên SH-SY5Y di plakayên şeş-qulikî de bi dendika 0.3 × 106 hucre/mL ji bo 24 demjimêran berî dermankirinê hatin mezin kirin. RNA bi karanîna protokola Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) bi guhertinên piçûk hate derxistin: berî rakirinê 300 μl tampona lîzê ya RNA li her qulikê zêde bikin û her nimûne wekî gavek dawîn bi 30 μl elusyona DNase/RNase lîz bikin. ava bê-av. Hemî nimûne ji bo hejmar û kalîteyê bi karanîna Spectrophotometreya NanoDrop ND-1000 UV-Vis hatin kontrol kirin. Proteîna tevahî ji lîzatên hucreyê bi karanîna tampona lîzê ya RIPA ya 200 μl hate bidestxistin, û konsantrasyona proteînê bi karanîna ceribandina proteîna Bradford70 hate hejmartin.
Senteza cDNA bi karanîna Kîta Synthesis a cDNA ya Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) li gorî rêwerzên çêker bi hin guhertinan hate kirin. cDNA di reaksiyonên 20-μl de bi karanîna 0.7 heta 1 μg RNA-ya tevahî hate sentezkirin. Prîmer ji gotarên berê yên weşandî 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabloya S1) hatin hilbijartin û sondajên pêvek bi karanîna amûra PrimerQuest ji Integrated DNA Technologies hatin sêwirandin. Hemî genên balkêş li gorî gena B2M ya navokî hatin normalîzekirin. Îfadeya genê ya STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC û OPA1 bi RT-qPCR hate pîvandin. Têkelê sereke polîmeraza LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 μM pêş û paş primer, cDNA, û ava pola PCR dihewîne da ku ji bo her reaksiyonê qebareya dawîn a 10 μL bide. Derbirîna genên dabeşkirin û fîsyonkirinê (DRP1, MFN1/2) bi karanîna ceribandinên piralî yên TaqMan hate pîvandin. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) li gorî rêwerzên çêker bi guhertinên piçûk hate bikar anîn. Têkelê sereke ya piralî ya RT-qPCR polîmeraza 1X LUNA Taq, 10 μM pêş û paş primer, 10 μM prob, cDNA, û ava pola PCR dihewîne, ku di encamê de ji bo her reaksiyonê qebareya dawîn a 20 μL da. RT-qPCR bi karanîna Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—hejmara rêzê: R0618110) hate kirin. Şert û mercên çerxerê di Tabloya S1 de têne nîşandan. Hemû nimûneyên cDNA sê caran hatin zêdekirin û bi karanîna rêze dilopkirinên deh qat xêzek standard hate çêkirin. Nirxên derveyî di nimûneyên sê caran de bi devîasyona standard a eşika çerxê (Ct) >0.5 ji analîzê hatin derxistin da ku dubarekirina daneyan were misogerkirin30,72. Îfadeya genê ya nisbî bi karanîna rêbaza 2-ΔΔCt79 hate hesabkirin.
Nimûneyên proteînê (60 μg) bi rêjeya 2:1 bi tampona barkirinê ya Laemmli re hatin tevlihevkirin û li ser jelek proteîna bêreng a %12 (Bio-Rad #1610184) hatin xebitandin. Proteîn bi karanîna pergala Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad) bo membrana PVDF (polîvînîlîden florîd) (#170-84156, Bio-Rad) hatin veguhastin. Membran hate astengkirin û bi antîkorên seretayî yên guncaw (OPA1, MFN1, MFN2, û DRP1) (di nav 1:1000 de hatine şilkirin) bo 48 demjimêran hate înkubasyonkirin, piştre bi antîkorên duyemîn (1:10,000) bo 1 demjimêran hate înkubasyonkirin. Piştre membran bi karanîna Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) hatin wênekirin û bi karanîna pergala Bio-Rad ChemiDoc MP hatin tomarkirin. Guhertoya ImageLab 6.1 ji bo analîza Western blot hate bikar anîn. Jel û blota orîjînal di Wêneya S1 de têne nîşandan. Agahiyên antîbodî di Tabloya S2 de têne peyda kirin.
Setên daneyan wekî navînî û xeletiya standard a navînî (SEM) ya herî kêm sê nimûneyên serbixwe têne pêşkêş kirin. Setên daneyan ji bo normalbûnê bi karanîna testa Shapiro-Wilks (heke nehatibe diyarkirin) berî ku belavkirina Gaussî û devîasyonên standard ên wekhev werin texmîn kirin û bi analîzan re berdewam bikin, hatin ceribandin. Ji bilî analîzkirina seta daneyan bi karanîna Fisher's MEL LSD (p < 0.05), ANOVA-ya yekalî (navîniya dermankirinê li hember kontrolê), û testa berawirdkirina pirjimar a Dunnett ji bo destnîşankirina girîngiyê (p < 0.05), nirxên p yên girîng di grafîkê de wekî *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 têne nîşandan. Hemî analîz û grafên îstatîstîkî bi karanîna GraphPad Prism 9.4.0 hatin kirin û çêkirin.
Makroyên Fiji/ImageJ ji bo analîza wêneyên TEM li ser GitHubê bi giştî hene: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makroya Mitochondrial Event Locator (MEL) li ser GitHubê bi giştî heye: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM û Vijaya A. Mîtokondri: rêkxerên sereke yên metabolîzmê, homeostaz, stres, pîrbûn û epîgenetîkê. Endonezyayî. Zanista Biyopizîşkî. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfonksiyona mîtokondrî ya piralî di şîzofreniyê de, kompleksa I wekî hedefek patolojîk a gengaz. Şîzofrenî. çavkanî. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. û Beal, MF Disfonksiyona mîtokondrî di nexweşiya Parkinson de. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG û Mehta V. Mîtokondriyên di bin stresê de: hedefên dagirkirinê di nexweşiya Alzheimer de. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF û Ferreira GK Mîtokondri û mejî: biyoenerjî û bêtir. Neurotoksîn. çavkanî. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. û yên din. Mîtokondriyên pleiotropîk: bandora mîtokondriyan li ser pêşketina neuronal û nexweşiyan. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. û Morais, VA Biyogeneza mîtokondrî di neuronan de: çawa û li ku derê. navneteweyîbûn. J. Mohr. zanist. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. û Zhao, J. Rêkxistina dînamîkên mîtokondrî yên memikan: derfet û zehmetî. pêş. endokrîn. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. û Slack, RS Dînamîkên mîtokondrî di rêkxistina neurogenezê de: ji mejiyê pêşketinê heta mezinbûnê. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).