Gotar beşek ji mijara lêkolînê ya "Baştirkirina berxwedana nîskên li hember nexweşî û kêzikan" e, hemû 5 gotaran bibînin
Sedema nexweşiya nekroza nebatan a fungî Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary stratejiyek pir-astî bikar tîne da ku nebatan mêvandar ên cûda vegirtî bike. Ev lêkolîn karanîna dîamîn L-ornîtîn, asîdek amînî ya ne-proteîn ku senteza asîdên amînî yên din ên bingehîn teşwîq dike, wekî stratejiyek rêveberiya alternatîf pêşniyar dike da ku bersivên molekulî, fîzyolojîk û biyokîmyayî yên Phaseolus vulgaris L. li hember qalibê spî yê ji hêla Pseudomonas sclerotiorum ve hatî çêkirin zêde bike. Ceribandinên in vitro nîşan dan ku L-ornîtîn bi awayekî girêdayî dozê mezinbûna mîselî ya S. pyrenoidosa bi girîngî asteng kir. Wekî din, ew dikare giraniya qalibê spî di bin şert û mercên serayê de bi girîngî kêm bike. Wekî din, L-ornîtîn mezinbûna nebatan ên dermankirî teşwîq kir, ku nîşan dide ku konsantrasyonên L-ornîtîn ên ceribandî ji bo nebatan fîtotoksîk nebûn. Herwiha, L-ornîtîn îfadeya antîoksîdanên ne-enzîmatîk (fenolîk û flavonoîdên tevahî yên çareserker) û antîoksîdanên enzîmatîk (katalaz (CAT), peroksîdaz (POX), û polîfenol oksîdaz (PPO)) zêde kir, û îfadeya sê genên têkildarî antîoksîdan (PvCAT1, PvSOD, û PvGR) zêde kir. Wekî din, analîza in silico hebûna proteînek oksaloasetat asetilhîdrolaz (SsOAH) ya gumanbar di genoma S. sclerotiorum de eşkere kir, ku di warê analîza fonksiyonel, domainên parastî û topolojiyê de pir dişibiya proteînên oksaloasetat asetilhîdrolaz (SsOAH) yên Aspergillus fijiensis (AfOAH) û Penicillium sp. (PlOAH). Bi balkêşî, lêzêdekirina L-ornîtîn li navgîna ava dekstrozê ya kartol (PDB) îfadeya gena SsOAH di mîkelyûma S. sclerotiorum de bi girîngî kêm kir. Bi heman awayî, sepandina eksojen a L-ornîtînê îfadeya gena SsOAH di mîselyayên fungî yên ji nebatan hatine dermankirin de bi girîngî kêm kir. Di dawiyê de, sepandina L-ornîtînê derdana asîda oksalîk hem di navgîna PDB û hem jî di pelên vegirtî de bi girîngî kêm kir. Di encamê de, L-ornîtînê di parastina rewşa redoks û her weha zêdekirina bersiva parastinê ya nebatan vegirtî de rolek sereke dilîze. Encamên vê lêkolînê dikarin di pêşxistina rêbazên nûjen û dostane yên jîngehê de ji bo kontrolkirina qalibê spî û kêmkirina bandora wê li ser hilberîna fasûlî û berhemên din de bibin alîkar.
Kelûpela spî, ku ji ber fungusa nekrotrofîk Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary çêdibe, nexweşiyeke wêranker û kêmker a berhemê ye ku gefê li hilberîna fasûlî (Phaseolus vulgaris L.) ya cîhanî dixwe (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum yek ji pathogenên nebatan ên fungî yên ku di axê de belav dibin û herî dijwar e ku were kontrol kirin e, bi rêzek mêvandar a berfireh ji zêdetirî 600 cureyên nebatan û şiyana wê ya zû tirşkirina tevnên mêvandar bi awayekî ne-taybet (Liang û Rollins, 2018). Di bin şert û mercên nebaş de, ew di qonaxek krîtîk a çerxa jiyana xwe de derbas dibe, ji bo demên dirêj wekî avahiyên reş, hişk, mîna tov ên bi navê 'sklerotia' di axê de an jî wekî mezinbûnên spî, nerm di mîselyûm an jî stûna stûnê ya nebatan vegirtî de bêçalak dimîne (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum dikare sklerotiyan çêbike, ku dihêle ew di zeviyên vegirtî de ji bo demên dirêj bijî û di dema nexweşiyê de berdewam bike (Schwartz et al., 2005). Sklerotî dewlemend bi xurekan in, dikarin di axê de ji bo demên dirêj berdewam bikin, û wekî înokuluma sereke ji bo enfeksiyonên paşê xizmet dikin (Schwartz et al., 2005). Di bin şert û mercên guncaw de, sklerotî şîn dibin û sporên hewayî çêdikin ku dikarin hemî beşên jorîn ên nebatan, di nav de kulîlk, qurm, an jî qalikan, vegirtî bikin (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum stratejiyeke pir-astî bikar tîne da ku nebatan bi xwe ve girêbide, ku rêze bûyerên hevrêzkirî ji şînbûna sklerotîyal bigire heya pêşveçûna nîşanan vedihewîne. Di destpêkê de, S. sclerotiorum sporên daliqandî (bi navê askospor) ji avahiyên mîna kivarkan ên bi navê apothecia çêdike, ku di hewayê de dibin û li ser bermayiyên nebatan ên vegirtî dibin sklerotîayên ne-tevger (Bolton et al., 2006). Dûv re kivark asîda oksalîk, faktorek virulansê, derdixe da ku pH-ya dîwarê şaneya nebatan kontrol bike, hilweşîna enzîmatîk û dagirkirina tevnan pêşve bibe (Hegedus û Rimmer, 2005), û teqîna oksîdatîf a nebata mêvandar tepeser bike. Ev pêvajoya asîdasyonê dîwarê şaneya nebatan qels dike, hawîrdorek guncan ji bo xebata normal û bi bandor a enzîmên hilweşîna dîwarê şaneya fungî (CWDE) peyda dike, dihêle ku patojen astengiya fîzîkî derbas bike û bikeve nav tevnên mêvandar (Marciano et al., 1983). Dema ku dikeve hundir, S. sclerotiorum hejmarek ji CWDE-yan derdixe, wek polygalacturonase û selulase, ku belavbûna wê di nav tevnên vegirtî de hêsan dike û dibe sedema nekroza tevnên. Pêşveçûna birînan û çîpên hîfalê dibe sedema nîşanên taybetmendî yên qaliba spî (Hegedus û Rimmer, 2005). Di vê navberê de, nebatên mêvandar qalibên molekulî yên bi patojenan ve girêdayî (PAMP) bi rêya receptorên naskirina qaliban (PRR) nas dikin, rêze bûyerên sînyalê didin destpêkirin ku di dawiyê de bersivên parastinê çalak dikin.
Tevî dehsalan hewldanên kontrolkirina nexweşiyan, di fasûliyê de, wekî di çandiniyên din ên bazirganî de, kêmbûna germoplazmaya berxwedêr a têrker hîn jî heye, ji ber berxwedan, jiyan û şiyana adapteyî ya patojenê. Ji ber vê yekê, birêvebirina nexweşiyan pir dijwar e û stratejiyek yekgirtî û piralî hewce dike ku têkeliyek ji pratîkên çandî, kontrola biyolojîk û fungîsîdên kîmyewî dihewîne (O'Sullivan et al., 2021). Kontrolkirina kîmyewî ya qaliba spî ya herî bibandor e ji ber ku fungîsîd, dema ku bi rêkûpêk û di wextê rast de werin sepandin, dikarin bi bandor belavbûna nexweşiyê kontrol bikin, giraniya enfeksiyonê kêm bikin û windahiyên berhemê kêm bikin. Lêbelê, zêde bikaranîn û zêde girêdana fungîsîd dikare bibe sedema derketina holê ya şaneyên berxwedêr ên S. sclerotiorum û bandorek neyînî li ser organîzmayên ne-armanc, tenduristiya axê û kalîteya avê bike (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Ji ber vê yekê, dîtina alternatîfên dostane yên jîngehê bûye pêşîniyek sereke.
Polîyamîn (PA), wek putrescîn, spermîdîn, spermîn, û kadaverîn, dikarin wekî alternatîfên sozdar li dijî patojenên nebatan ên di axê de belav dibin xizmet bikin, bi vî rengî karanîna fungîsîdên kîmyewî yên xeternak bi tevahî an qismî kêm bikin (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Di nebatan bilindtir de, PA di gelek pêvajoyên fîzyolojîk de beşdar in, di nav de, lê ne bi tenê, dabeşbûna hucreyê, cûdakirin, û bersiva li hember stresên abiyotîk û biyotîk (Kiliny û Nehela, 2020). Ew dikarin wekî antîoksîdan tevbigerin, bibin alîkar ku cureyên oksîjenê yên reaktîf (ROS) werin paqijkirin, homeostaza redoks biparêzin (Nehela û Killiny, 2023), genên têkildarî parastinê çalak bikin (Romero et al., 2018), rêyên metabolîk ên cûrbecûr rêk bixin (Nehela û Killiny, 2023), fîtohormonên endojîn modüle bikin (Nehela û Killiny, 2019), berxwedana sîstemîk a bi dest xistî (SAR) ava bikin, û têkiliyên nebat-pathogen rêk bixin (Nehela û Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Hêjayî gotinê ye ku mekanîzmay û rolên taybetî yên PA-yan di parastina nebatan de li gorî cureyên nebatan, patojenan û şert û mercên hawîrdorê diguherin. PA-ya herî zêde di nebatan de ji polîamîn L-ornîtînê ya bingehîn tê biyosentezkirin (Kiliny û Nehela, 2020).
L-ornîtîn di mezinbûn û pêşveçûna nebatan de gelek rolan dilîze. Bo nimûne, lêkolînên berê nîşan dane ku di birinc (Oryza sativa) de, ornîtîn dibe ku bi vegerandina nîtrojenê (Liu et al., 2018), berhem, kalîte û bêhna birinc (Lu et al., 2020), û bersiva stresa avê (Yang et al., 2000) ve girêdayî be. Wekî din, sepandina eksojen a L-ornîtîn toleransa ziwabûnê di nebatên şekirê şekir (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) de bi girîngî zêde kir û stresa xwê di nebatên pîvaz (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu û Çavuşoǧlu, 2021) û gûzê hindî (Anacardium occidentale) de sivik kir (da Rocha et al., 2012). Rola potansiyel a L-ornîtîn di parastina ji stresa abiyotîk de dibe ku ji ber beşdarbûna wê di kombûna prolînê de di nebatên dermankirî de be. Bo nimûne, genên têkildarî metabolîzma prolînê, wek genên ornîtîn delta aminotransferaz (delta-OAT) û prolîn dehîdrojenaz (ProDH1 û ProDH2), berê hatiye ragihandin ku di parastina Nicotiana benthamiana û Arabidopsis thaliana li dijî şaneyên Pseudomonas syringae yên ne-mêvandar de beşdar in (Senthil-Kumar û Mysore, 2012). Ji aliyekî din ve, ornîtîn dekarboksîlaza fungî (ODC) ji bo mezinbûna patojenan pêwîst e (Singh et al., 2020). Armanckirina ODC ya Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici bi rêya bêdengkirina genê ya ji hêla mêvandar ve hatî çalak kirin (HIGS) berxwedana nebatan tomato li hember Fusarium wilt bi girîngî zêde kir (Singh et al., 2020). Lêbelê, rola potansiyel a sepandina ornîtîn a eksojen li dijî stresên biyotîk ên wekî fîtopatojenan baş nehatiye lêkolîn kirin. Ya girîngtir, bandorên ornîtînê li ser berxwedana li hember nexweşiyan û diyardeyên biyokîmyayî û fîzyolojîk ên pê re têkildar bi piranî nehatine vekolandin.
Têgihîştina tevliheviya enfeksiyona S. sclerotiorum a li ser nîskiyan ji bo pêşxistina stratejiyên kontrolê yên bi bandor girîng e. Di vê lêkolînê de, me armanc kir ku rola potansiyel a dîamîn L-ornîtînê wekî faktorek sereke di baştirkirina mekanîzmayên parastinê û berxwedana nebatan nîskiyan li hember enfeksiyona Sclerotinia sclerotiorum de destnîşan bikin. Em texmîn dikin ku, ji bilî baştirkirina bersivên parastinê yên nebatan vegirtî, L-ornîtînê di parastina rewşa redoks de jî rolek sereke dilîze. Em pêşniyar dikin ku bandorên potansiyel ên L-ornîtînê bi rêkxistina mekanîzmayên parastinê yên antîoksîdan ên enzîmatîk û ne-enzîmatîk û destwerdana bi faktorên patojenîtî/vîrulansê yên fungî û proteînên têkildar ve girêdayî ne. Ev fonksiyona dualî ya L-ornîtînê wê dike namzetek sozdar ji bo stratejiyek domdar ji bo kêmkirina bandora qalibê spî û zêdekirina berxwedana berhemên nîskiyan ên hevpar li hember vê patojena fungî ya bihêz. Encamên vê lêkolînê dikarin di pêşxistina rêbazên nûjen û dostane yên jîngehê de ji bo kontrolkirina qalibê spî û kêmkirina bandora wê li ser hilberîna nîskiyan bibin alîkar.
Di vê lêkolînê de, cureyekî bazirganî yê hesas ê fasûlyeya asayî, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), wekî materyalê ceribandinê hate bikar anîn. Tovên saxlem ji hêla Beşa Lêkolînên Baqiyan, Enstîtuya Lêkolînên Çandiniyên Zeviyê (FCRI), Navenda Lêkolînên Çandiniyê (ARC), Misir ve bi dilxwazî ​​​​hatin peyda kirin. Pênc tov di potên plastîk de (qûtra hundirîn 35 cm, kûrahî 50 cm) ku bi axa enfeksiyona S. sclerotiorum tije bûn, di bin şert û mercên serayê de (25 ± 2 °C, şilbûna nisbî 75 ± 1%, 8 demjimêr ronahî / 16 demjimêr tarî) hatin çandin. Di 7-10 rojan de piştî çandinê (DPS), şitl hatin zirav kirin da ku tenê du şitl bi mezinbûna yekreng û sê pelên bi tevahî fireh di her potê de bimînin. Hemî nebatên di potê de her du hefteyan carekê hatin avdan û mehane bi rêjeya pêşniyarkirî ji bo cureyê dayîn hatin gubrekirin.
Ji bo amadekirina rêjeyek 500 mg/L ji L-ornîtînedîaminê (ku wekî (+)-(S)-2,5-dîamînopentanoîk asîd jî tê zanîn; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya) 50 mg pêşî di 100 mL ava distîlekirî ya sterîl de hate helandin. Dûv re çareseriya stok hate şilkirin û di ceribandinên paşîn de hate bikar anîn. Bi kurtasî, şeş rêze rêjeyên L-ornîtîn (12.5, 25, 50, 75, 100, û 125 mg/L) di vitro de hatin ceribandin. Wekî din, ava distîlekirî ya sterîl wekî kontrolek neyînî (Mock) hate bikar anîn û toza şilkirinê ya fungîsîda bazirganî "Rizolex-T" 50% (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Guvernatora Gharbia, Misir) wekî kontrolek erênî hate bikar anîn. Fungîsîda bazirganî "Rizolex-T" di pênc konsantrasyonan de (2, 4, 6, 8 û 10 mg/L) di vitro de hat ceribandin.
Nimûneyên qurm û qalikên fasûliyên hevpar ên ku nîşanên tîpîk ên qaliba spî nîşan didin (rêjeya enfeksiyonê: 10-30%) ji zeviyên bazirganî hatin berhevkirin. Her çend piraniya materyalên nebatan ên vegirtî li gorî cure/cûre hatine destnîşankirin (cureya bazirganî ya hesas Giza 3), yên din, nemaze yên ku ji bazarên herêmî hatine wergirtin, ji cureyên nenas bûn. Materyalên vegirtî yên berhevkirî pêşî bi çareseriya sodyûm hîpoklorît a 0.5% ji bo 3 hûrdeman hatin dezenfektekirin, dûv re çend caran bi ava distîlekirî ya sterîl hatin şuştin û bi kaxiza parzûnê ya sterîl hatin hişkkirin da ku ava zêde were rakirin. Piştre organên vegirtî ji tevna navîn (di navbera tevnên saxlem û vegirtî de) perçeyên piçûk hatin birîn, li ser agarê dekstroza kartol (PDA) hatin çandin û di 25 ± 2 °C de bi çerxek ronahî/tarî ya 12 demjimêran ji bo 5 rojan hatin înkubasyonkirin da ku çêbûna sklerotîayê were teşwîqkirin. Rêbaza serê mîselî jî ji bo paqijkirina îzolekirinên fungî ji çandên tevlihev an jî qirêj hat bikar anîn. Îzoleya fungî ya paqijkirî pêşî li gorî taybetmendiyên wê yên morfolojîk ên çandî hat destnîşankirin û dûv re li gorî taybetmendiyên mîkroskopîk hat piştrast kirin ku S. sclerotiorum e. Di dawiyê de, hemû îzolasyonên safîkirî li ser cureya fasûlyeya hevpar a hesas Giza 3 ji bo patojenîtiyê hatin ceribandin da ku li gorî postulatên Koch bin.
Herwiha, îzoleya S. sclerotiorum a herî dagirker (îzoleya #3) li ser bingeha rêzkirina spacer a transkrîpsiyona navxweyî (ITS) wekî ku ji hêla White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ve hatî vegotin, bêtir hate piştrast kirin. Bi kurtasî, îzole di ava dekstroza kartol (PDB) de hatin çandin û di 25 ± 2 °C de ji bo 5-7 rojan hatin înkubasyon kirin. Piştre mîselyûma fungal hate berhev kirin, bi penêrê hate fîltre kirin, du caran bi ava sterîl hate şuştin, û bi kaxiza fîlterê ya sterîl hate hişk kirin. DNAya genomîk bi karanîna Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) hate îzole kirin. Herêma rDNA ya ITSê paşê bi karanîna cotek prîmer a taybetî ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; mezinahiya tê payîn: 540 bp) hate zêdekirin (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Berhemên PCRê yên safîkirî ji bo rêzkirinê hatin şandin (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Rêzên rDNA yên ITSê bi awayekî dualî bi karanîna rêbaza rêzkirina Sanger hatin rêzkirin. Rêzên lêpirsînê yên komkirî paşê bi daneyên herî dawî yên di GenBank û Navenda Neteweyî ya Agahdariya Biyoteknolojiyê (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) de bi karanîna nermalava BLASTn hatin berhev kirin. Rêzeya lêpirsînê bi 20 şaneyên/îzolasyonên din ên S. sclerotiorum ên ku ji daneyên herî dawî yên di NCBI GenBank (Tabloya Pêvek S1) de bi karanîna ClustalW di Pakêta Analîza Genetîkî ya Pêşketina Molekulî de (MEGA-11; guhertoya 11) hatine wergirtin re hate berhev kirin (Kumar et al., 2024). Analîza pêşkeftinê bi karanîna rêbaza îhtîmala herî zêde û modela guheztina nukleotîdê ya dem-berevajî ya giştî hate kirin (Nei û Kumar, 2000). Dara bi îhtîmala lojîstîkê ya herî bilind tê nîşandan. Dara destpêkê ji bo lêgerîna heurîstîk bi hilbijartina dara bi îhtîmala lojîstîkê ya bilindtir di navbera dara hevgirtina cîran (NJ) (Kumar et al., 2024) û dara parsimony ya herî zêde (MP) de tê hilbijartin. Dara NJ bi karanîna matrîksa dûrbûna cot-cot a ku bi karanîna modela dem-berevajî ya giştî hatî hesibandin hate çêkirin (Nei û Kumar, 2000).
Çalakiya antîbakteriyal a L-ornîtîn û bakterîsîd "Rizolex-T" bi rêbaza belavbûna agarê di vitro de hate destnîşankirin. Rêbaz: Ji bo amadekirina çareseriyên bi konsantrasyonên dawîn ên 12.5, 25, 50, 75, 100 û 125 mg/L, mîqdara guncaw a çareseriya stokê ya L-ornîtîn (500 mg/L) bigirin û bi tevahî bi 10 ml ji navgîna xurekê ya PDA re tevlihev bikin. Pênc konsantrasyonên fungîsîdê "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 û 10 mg/L) û ava distîlkirî ya sterîl wekî kontrol hatin bikar anîn. Piştî ku navgîn hişk bû, pêvekek mîselî ya nû amadekirî ya çanda Sclerotinia sclerotiorum, bi qûtra 4 mm, hate veguheztin navenda kasa Petri û di 25±2°C de hate çandin heta ku mîselyûm tevahiya kasa Petri ya kontrolê veşart, piştî vê yekê mezinbûna fungî hate tomar kirin. Rêjeya astengkirina mezinbûna radyal a S. sclerotiorum bi karanîna hevkêşeya 1 hesab bikin:
Ceribandin du caran hate dubarekirin, bi şeş dubarekirinên biyolojîk ji bo her koma kontrol/ceribandinê û pênc sarincok (du nebat di her sarincokê de) ji bo her dubarekirina biyolojîk. Her dubarekirina biyolojîk du caran hate analîzkirin (du dubarekirinên teknîkî) da ku rastbûn, pêbawerî û dubarekirina encamên ceribandinê were misogerkirin. Wekî din, analîza regresyona probit hate bikar anîn da ku nîv-herî zêde konsantrasyona astengker (IC50) û IC99 were hesab kirin (Prentice, 1976).
Ji bo nirxandina potansiyela L-ornîtînê di bin şert û mercên serayê de, du ceribandinên potikan ên li pey hev hatin kirin. Bi kurtasî, potik bi axa gil-qûmê ya sterîlkirî (3:1) hatin dagirtin û bi çandeke nû amadekirî ya S. sclerotiorum hatin derzîkirin. Pêşî, îzoleya herî dagirker a S. sclerotiorum (îzoleya #3) bi qutkirina yek sklerotîumê di nîvî de, danîna wê bi rûyê xwe ber bi jêr ve li ser PDA-yê û înkubasyona li 25°C di tariyeke domdar de (24 demjimêr) ji bo 4 rojan ji bo teşwîqkirina mezinbûna mîselî hate çandin. Dûv re çar pêvekên agarê yên bi qûtra 5 mm ji qiraxa pêşiyê hatin girtin û bi 100 g tevliheviyeke sterîl a genim û birincê (1:1, v/v) hatin derzîkirin û hemî firax di 25 ± 2°C de di bin çerxek ronahî/tarî ya 12 demjimêran de ji bo 5 rojan ji bo teşwîqkirina çêbûna sklerotîa hatin înkubasyonkirin. Naveroka hemî firaxan bi tevahî hate tevlihevkirin da ku berî lêzêdekirina axê homojenî were misogerkirin. Paşê, 100 g ji tevliheviya kevroşkê ya kolonîzeker li her potikê hat zêdekirin da ku rêjeya mîkroban domdar be. Potikên derzîkirî hatin avdan da ku mezinbûna fungî çalak bibe û 7 rojan di şert û mercên serayê de hatin danîn.
Piştre pênc tovên ji cureya Giza 3 di her potikê de hatin çandin. Ji bo potikên ku bi L-ornîtîn û fungîsîda Rizolex-T hatine dermankirin, tovên sterîlkirî pêşî du saetan di çareseriyeke avî ya her du pêkhateyan de bi rêjeya dawî ya IC99 ya bi qasî 250 mg/L û 50 mg/L hatin şilkirin, û dûv re berî çandinê saetekê di hewayê de hatin zuwakirin. Ji aliyê din ve, tov wekî kontroleke neyînî di ava distîlkirî ya sterîl de hatin şilkirin. Piştî 10 rojan, berî avdana yekem, şitl hatin ziravkirin, di her potikê de tenê du şitlên paqij man. Wekî din, ji bo misogerkirina enfeksiyona bi S. sclerotiorum, qurmên nebatan ên fasûliyê di heman qonaxa pêşveçûnê de (10 roj) bi karanîna skalpelek sterîlkirî li du cihên cûda hatin birîn û bi qasî 0,5 g ji tevliheviya kepçeya kolonîzeker di her birînê de hat danîn, dûv re jî şilbûna bilind hat danîn da ku enfeksiyon û pêşveçûna nexweşiyê di hemî nebatan de were teşwîqkirin. Nebatên kontrolê bi heman awayî hatin birîndarkirin û mîqdarek wekhev (0.5 g) ji tevliheviya kewçêr a sterîl û nekolonîzekirî hat danîn nav birînê û di bin şilbûna bilind de hat parastin da ku jîngeh ji bo pêşveçûna nexweşiyê simul bike û hevgirtinê di navbera komên dermankirinê de misoger bike.
Rêbaza dermankirinê: Şitilên fasûliyê bi 500 ml çareseriya avî ya L-ornîtîn (250 mg/l) an jî fungîsîda Rizolex-T (50 mg/l) bi avdana axê hatin avdan, paşê dermankirin sê caran bi navberek 10 rojan hate dubarekirin. Kontrolên ku bi plasebo hatine dermankirin bi 500 ml ava distîlekirî ya sterîl hatin avdan. Hemû dermankirin di şert û mercên serayê de (25 ± 2°C, 75 ± 1% şilbûna nisbî, û fotoperiod 8 demjimêr ronahî / 16 demjimêr tarî) hatin kirin. Hemû kulîlk du hefte carekê hatin avdan û mehane bi gubreyek NPK ya hevseng (20-20-20, bi 3.6% sulfur û mîkroelementên TE; Zain Seeds, Misir) bi rêjeya 3-4 g/l bi spreykirina pelî li gorî pêşniyarên ji bo cûreya taybetî û rêwerzên çêker hatin dermankirin. Heger nehatibe diyarkirin, pelên gihîştî yên bi tevahî firehbûyî (pelên 2yemîn û 3yemîn ji jor) ji her dubarekirina biyolojîkî di 72 demjimêran piştî dermankirinê (hpt) de hatin berhevkirin, homojenîzekirin, komkirin û di -80°C de ji bo analîzên din hatin hilanîn, di nav de, lê ne bi tenê, cihê hîstokîmyayî yê di cîh de yê nîşaneyên stresa oksîdatîf, peroksîdasyona lîpîdan, antîoksîdanên enzîmatîk û ne-enzîmatîk û îfadeya genan.
Şîdeta enfeksiyona qaliba spî heftane 21 roj piştî derzîkirinê (dpi) bi karanîna pîvanek 1-9 (Tabloya Pêvek S2) li gorî pîvana Petzoldt û Dickson (1996) ku ji hêla Teran et al. (2006) ve hatî guhertin hate nirxandin. Bi kurtasî, qurm û şaxên nebatan fasûlî ji xala derzîkirinê dest pê kirin hatin lêkolîn kirin da ku pêşveçûna birînan li seranserê navgirêk û girêkan bişopînin. Dûrahiya birînê ji xala derzîkirinê heya xala herî dûr li ser stûn an şaxê dûv re hate pîvandin û li gorî cihê birînê puanek 1-9 hate destnîşankirin, ku (1) nîşan dide ku enfeksiyonek xuya tune ye li nêzî xala derzîkirinê û (2-9) zêdebûnek hêdî hêdî di mezinahiya birîn û pêşveçûna li seranserê girêk/navgirêkan de nîşan dide (Tabloya Pêvek S2). Şîdeta enfeksiyona qaliba spî dûv re bi karanîna formula 2 veguherî rêjeyê:
Herwiha, qada di bin xêza pêşveçûna nexweşiyê de (AUDPC) bi karanîna formula (Shaner û Finney, 1977) hate hesabkirin, ku vê dawiyê ji bo rizîna spî ya fasûlyeya asayî (Chauhan et al., 2020) bi karanîna hevkêşeya 3-an hate adaptekirin:
Li vir Yi = giraniya nexweşiyê di dema ti de, Yi+1 = giraniya nexweşiyê di dema din de ti+1, ti = dema pîvandina yekem (bi rojan), ti+1 = dema pîvandina din (bi rojan), n = hejmara giştî ya xalên demê an xalên çavdêriyê. Parametreyên mezinbûna nebata fasûliyê, tevî bilindahiya nebatê (cm), hejmara şaxan ji bo her nebatê, û hejmara pelên ji bo her nebatê, di hemî dubarekirinên biyolojîkî de heftane ji bo 21 rojan hatin tomar kirin.
Di her dubarekirina biyolojîk de, nimûneyên pelan (pelên duyem û sêyem ên bi temamî pêşketî ji jor) di roja 45an piştî dermankirinê de (15 roj piştî dermankirina dawî) hatin berhevkirin. Her dubarekirina biyolojîk ji pênc potikan pêk dihat (du nebat di her potikê de). Nêzîkî 500 mg ji tevna pelçiqandî ji bo derxistina rengdêrên fotosentezê (klorofîl a, klorofîl b û karotenoîd) bi karanîna asetonê %80 di 4°C de di tariyê de hat bikar anîn. Piştî 24 demjimêran, nimûne hatin santrifujkirin û supernatant ji bo destnîşankirina naveroka klorofîl a, klorofîl b û karotenoîd bi awayekî kolorîmetrîk bi karanîna spektrofotometreyek UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonya) li gorî rêbaza (Lichtenthaler, 1987) bi pîvandina vegirtinê li sê dirêjahiyên pêlên cûda (A470, A646 û A663 nm) hat berhevkirin. Di dawiyê de, naveroka rengdêrên fotosentezê bi karanîna formulên jêrîn 4-6 yên ku ji hêla Lichtenthaler (1987) ve hatine vegotin hat hesabkirin.
Piştî 72 demjimêran piştî dermankirinê (hpt), pel (pelên duyemîn û sêyemîn ên bi tevahî pêşkeftî ji jor) ji her dubarekirina biyolojîkî ji bo cihê hîstokîmyayî yê di cîh de yê hîdrojen peroksît (H2O2) û anyona superoksît (O2•−) hatin berhevkirin. Her dubarekirina biyolojîkî ji pênc potan pêk dihat (du nebat di her potê de). Her dubarekirina biyolojîkî du caran (du dubarekirinên teknîkî) hate analîzkirin da ku rastbûn, pêbawerî û dubarekirina rêbazê were misoger kirin. H2O2 û O2•− bi karanîna 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya) an nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya) bi rêzê ve, bi şopandina rêbazên ku ji hêla Romero-Puertas et al. (2004) û Adam et al. (1989) ve bi guhertinên piçûk hatine vegotin, hatin destnîşankirin. Ji bo cihê histokîmyayî yê H2O2 di cîh de, belavok bi 0.1% DAB di nav tampona Tris a 10 mM (pH 7.8) de di valahiyê de hatin înfîltrekirin û dûv re di germahiya odeyê de di bin ronahiyê de ji bo 60 hûrdeman hatin înkubasyonkirin. Belavok di 0.15% (v/v) TCA di 4:1 (v/v) etanol:kloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Qahîre, Misir) de hatin spîkirin û dûv re heta ku tarî bibin di bin ronahiyê de man. Bi heman awayî, valv bi tampona fosfata potasyûmê ya 10 mM (pH 7.8) ku 0.1 w/v % HBT tê de heye, di valahiyê de hatin înfîltrekirin ji bo cihê histokîmyayî yê O2•− di cîh de. Belavok di germahiya odeyê de ji bo 20 hûrdeman hatin înkubasyonkirin, dûv re wekî jorîn hatin spîkirin, û dûv re heta ku xalên şîn/binefşî yên tarî xuya bibin hatin ronîkirin. Şiddeta rengê qehweyî (wek nîşaneya H2O2) an jî şîn-binefşî (wek nîşaneya O2•−) bi karanîna guhertoya Fiji ya pakêta pêvajoya wêneyê ImageJ (http://fiji.sc; gihîştin 7ê Adara 2024an) hate nirxandin.
Malondialdehyde (MDA; wekî nîşaneyek ji bo peroksîdasyona lîpîdan) li gorî rêbaza Du û Bramlage (1992) bi guhertinên piçûk hat destnîşankirin. Pelên ji her dubareya biyolojîkî (pelên duyemîn û sêyemîn ên bi tevahî pêşkeftî ji jor) 72 demjimêr piştî dermankirinê (hpt) hatin berhevkirin. Her dubareya biyolojîkî pênc potikan dihewîne (du nebat di her potikê de). Her dubareya biyolojîkî du caran hat analîzkirin (du dubareyên teknîkî) da ku rastbûn, pêbawerî û dubarebûna rêbazê were misoger kirin. Bi kurtasî, 0.5 g ji tevna pelê ya hûrkirî ji bo derxistina MDA bi 20% asîda trîkloroasetîk (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) ku 0.01% hîdroksîtoluenê bûtîlkirî (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tê de heye hat bikar anîn. Paşê naveroka MDA di nav supernatantê de bi pîvandina absorbansê li 532 û 600 nm bi karanîna spektrofotometreyek UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonya) bi awayekî kolorimetrîk hate destnîşankirin û dûv re wekî nmol g−1 FW hate îfade kirin.
Ji bo nirxandina antîoksîdanên ne-enzîmatîk û enzîmatîk, pel (pelên duyemîn û sêyemîn ên bi tevahî pêşkeftî ji jor) ji her dubareya biyolojîk di 72 demjimêran piştî dermankirinê (hpt) de hatin berhevkirin. Her dubareya biyolojîk ji pênc potan pêk dihat (du nebat di her potê de). Her nimûneya biyolojîkî du caran hate analîzkirin (du nimûneyên teknîkî). Du pel bi nîtrojena şil hatin hûrkirin û rasterast ji bo destnîşankirina antîoksîdanên enzîmatîk û ne-enzîmatîk, asîdên amînî yên tevahî, naveroka prolîn, îfadeya genan û pîvandina oksalatê hatin bikar anîn.
Fenolîkên tevahî yên çareserker bi karanîna reaktîfa Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bi guhertinên piçûk ên rêbaza ku ji hêla Kahkonen et al. (1999) ve hatî vegotin hatin destnîşankirin. Bi kurtasî, bi qasî 0.1 g ji tevna pelê ya homojenkirî bi 20 ml metanola %80 di tariyê de ji bo 24 demjimêran hate derxistin û piştî santrifujkirinê serperişt hate berhevkirin. 0.1 ml ji ekstrakta nimûneyê bi 0.5 ml reaktîfa Folin-Ciocalteu (%10) re hate tevlihev kirin, ji bo 30 saniyeyan hate hejandin û 5 deqîqeyan di tariyê de hate hiştin. Dûv re 0.5 ml ji çareseriya karbonata sodyûmê ya %20 (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Qahîre, Misir) li her lûleyê hate zêdekirin, bi tevahî hate tevlihev kirin û di germahiya odeyê de ji bo 1 demjimêran di tariyê de hate înkubasyon kirin. Piştî înkubasyonê, vegirtina tevliheviya reaksiyonê li 765 nm bi karanîna spektrofotometreyek UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonya) hate pîvandin. Têkeliya tevahîya fenolên çareserker di ekstraktên nimûneyê de bi karanîna xêza kalibrkirina asîda gallîk (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) hate destnîşankirin û wekî milîgramek ekîvalenta asîda gallîk ji bo her gram giraniya teze (mg GAE g-1 giraniya teze) hate îfade kirin.
Naveroka tevahî ya flavonoîdên çareserker li gorî rêbaza Djeridane et al. (2006) bi guhertinên piçûk hat destnîşankirin. Bi kurtasî, 0.3 ml ji ekstrakta metanolê ya jorîn bi 0.3 ml çareseriya klorîda aluminiumê ya %5 (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) re hat tevlihevkirin, bi tundî hat tevlihevkirin û dûv re 5 deqîqeyan li germahiya odeyê hat înkubasyonkirin, dûv re 0.3 ml çareseriya asetata potasyûmê ya %10 (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Qahîre, Misir) hat zêdekirin, bi tevahî hat tevlihevkirin û 30 deqîqeyan di tariyê de li germahiya odeyê hat înkubasyonkirin. Piştî înkubasyonê, vegirtina tevliheviya reaksiyonê li 430 nm bi karanîna spektrofotometreyek UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonya) hat pîvandin. Têkeliya tevahî ya flavonoîdên çareserker di ekstraktên nimûneyê de bi karanîna xêza kalibrkirina rûtîn (TCI America, Portland, OR, USA) hat destnîşankirin û dûv re wekî milîgramek hevsengiya rûtîn ji bo her gram giraniya teze (mg RE g-1 giraniya teze) hat îfadekirin.
Naveroka giştî ya asîda amînî ya azad a pelên fasûliyê bi karanîna reaktîfek nînhîdrîn a guhertî (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) li gorî rêbaza ku ji hêla Yokoyama û Hiramatsu (2003) ve hatî pêşniyar kirin û ji hêla Sun et al. (2006) ve hatî guherîn hate destnîşankirin. Bi kurtasî, 0.1 g ji tevna hûrkirî bi tampona pH 5.4 hate derxistin, û 200 μL ji supernatant bi 200 μL nînhîdrîn (2%) û 200 μL pîrîdîn (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA re reaksiyon hate kirin, di hemamek ava kelandî de ji bo 30 hûrdeman hate înkubasyon kirin, dûv re hate sar kirin û di 580 nm de bi karanîna spektrofotometreyek UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonya) hate pîvandin. Ji hêla din ve, prolîn bi rêbaza Bates hate destnîşankirin (Bates et al., 1973). Prolîn bi asîda sulfosalîsîlîk a %3 (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) hate derxistin û piştî santrifujkirinê, 0.5 ml ji supernatantê bi 1 ml asîda asetîk a qeşayî (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) û reaktîfa nînhîdrîn re hate tevlihevkirin, di 90°C de ji bo 45 deqîqeyan hate înkubasyonkirin, hate sarkirin û bi karanîna heman spektrofotometreyê wekî jorîn di 520 nm de hate pîvandin. Asîdên amînî yên azad ên tevahî û prolîn di ekstraktên pelan de bi karanîna xêzên kalibrasyonê yên glîsîn û prolînê (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) bi rêzê ve hatin destnîşankirin, û wekî mg/g giraniya teze hatin îfadekirin.
Ji bo diyarkirina çalakiya enzîmatîk a enzîmên antîoksîdan, bi qasî 500 mg tevnên homojenkirî bi 3 ml tampona Tris a 50 mM (pH 7.8) ku 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) û 7.5% polîvînîlpîrolîdon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tê de heye, hatin derxistin, di 10,000 × g de ji bo 20 hûrdeman di bin sarincê de (4 °C) hatin santrifujkirin, û supernatant (ekstrakta enzîma xav) hat berhevkirin (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalaz (CAT) dû re bi 2 ml tampona fosfata sodyûmê ya 0.1 M (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) û 100 μl çareseriya H2O2 ya 269 mM re reaksiyon kir da ku çalakiya wê ya enzîmatîk li gorî rêbaza Aebi (1984) bi guhertinên piçûk were destnîşankirin (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Çalakiya enzîmatîk a peroksîdaza girêdayî Guaiacol (POX) bi karanîna rêbaza Harrach et al. (2009) hate destnîşankirin. (2008) bi guhertinên piçûk (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) û çalakiya enzîmatîk a polîfenol oksîdazê (PPO) piştî reaksiyonê bi 2.2 ml tampona sodyûm fosfatê ya 100 mM (pH 6.0), 100 μl guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) û 100 μl H2O2 ya 12 mM hate destnîşankirin. Rêbaz ji (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) hinekî hate guhertin. Ceribandin piştî reaksiyonê bi 3 ml çareseriya katekolê (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) ku nû di tampona fosfatê ya 0.1 M (pH 6.0) de hatiye amadekirin, hate kirin. Çalakiya CAT bi şopandina hilweşîna H2O2 li 240 nm (A240) hate pîvandin, çalakiya POX bi şopandina zêdebûna vegirtinê li 436 nm (A436) hate pîvandin, û çalakiya PPO bi tomarkirina guherînên vegirtinê li 495 nm (A495) her 30 saniyeyan ji bo 3 hûrdeman bi karanîna spektrofotometreyek UV-160A (Shimadzu, Japonya) hate pîvandin.
RT-PCR-ya demrast ji bo tespîtkirina asta transkrîptê ya sê genên têkildarî antîoksîdan, di nav de katalaza peroksîsomal (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoksîd dismutaz (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), û glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), di pelên fasûliyê de (pelên duyemîn û sêyemîn ên bi tevahî pêşkeftî ji jor) 72 demjimêr piştî dermankirina dawî hate bikar anîn. Bi kurtasî, RNA bi karanîna Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) li gorî protokola çêker hate veqetandin. Dûv re, cDNA bi karanîna TOP script™ cDNA Synthesis Kit li gorî rêwerzên çêker hate sentezkirin. Rêzên primer ên sê genên jorîn di Tabloya Pêvek S3 de hatine navnîş kirin. PvActin-3 (jimara gihîştina GenBank: XM_068616709.1) wekî gena paqijiyê hate bikar anîn û îfadeya gena têkildar bi karanîna rêbaza 2-ΔΔCT hate hesabkirin (Livak û Schmittgen, 2001). Aramiya aktînê di bin stresa biyotîk (têkiliya nelihevhatî di navbera nîskên hevpar û fungusa antraknoz Colletotrichum lindemuthianum) û stresa abiyotîk (hişkbûn, şorbûn, germahiya nizm) de hate nîşandan (Borges et al., 2012).
Me di destpêkê de analîzek in silico ya proteînên oksaloasetat asetilhîdrolaz (OAH) di S. sclerotiorum de bi karanîna amûra proteîn-proteîn BLAST (BLASTp 2.15.0+) pêk anî (Altschul et al., 1997, 2005). Bi kurtasî, me OAH ji Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; hejmara gihîştina GenBank XP_040799428.1; 342 asîdên amînî) û Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; hejmara gihîştina GenBank XP_056833920.1; 316 asîdên amînî) wekî rêzikên lêpirsînê bikar anîn da ku proteîna homolog di S. sclerotiorum (taxide: 5180) de nexşe bikin. BLASTp li dijî daneyên genoma S. sclerotiorum ên herî dawî yên di GenBank-ê de li ser malpera Navenda Neteweyî ya Agahdariya Biyoteknolojiyê (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/, hate kirin.
Herwiha, gena OAH ya pêşbînîkirî ji S. sclerotiorum (SsOAH) û analîza evolusyonî û dara fîlojenetîk a AfOAH ji A. fijiensis CBS 313.89 û PlOAH ji P. lagena bi karanîna rêbaza îhtîmala herî zêde di MEGA11 de (Tamura et al., 2021) û modela JTT-ya li ser bingeha matrîksê (Jones et al., 1992) hatin texmînkirin. Dara fîlojenetîk bi analîza hevrêzkirina pirjimar a rêzikên proteînê yên hemî genên OAH yên pêşbînîkirî (SsOAH) ji S. sclerotiorum û rêza lêpirsînê bi karanîna Amûra Hevrêzkirina Li ser Bingeha Bingehîn (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos û Agarwala, 2007) re hate hev kirin. Herwiha, rêzikên asîdên amînî yên herî baş ên lihevhatî yên SsOAH ji S. sclerotiorum bi rêzikên lêpirsînê (AfOAH û PlOAH) (Larkin et al., 2007) bi karanîna ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) hatin hevrêzkirin, û herêmên parastî di hevrêzkirinê de bi karanîna amûra ESPript (guhertoya 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) hatin xuyangkirin.
Her wiha, domainên nûnerên fonksiyonel ên pêşbînîkirî û cihên parastî yên S. sclerotiorum SsOAH bi awayekî înteraktîf di nav malbatên cûda de bi karanîna amûra InterPro hatin dabeş kirin (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Di dawiyê de, modela avahiya sê-alî (3D) ya S. sclerotiorum SsOAH ya pêşbînîkirî bi karanîna Motora Naskirina Homolojî/Analogy ya Proteînê (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) hate kirin û bi karanîna servera SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) hate pejirandin (Biasini et al., 2014). Avahiyên sê-alî yên pêşbînîkirî (formata PDB) bi karanîna pakêta UCSF-Chimera (guhertoya 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) bi awayekî înteraktîf hatin xuyangkirin (Pettersen et al., 2004).
PCR-ya fluoresansa demrast a hejmarî ji bo destnîşankirina asta transkrîpsiyonê ya oksaloacetate acetilhîdrolazê (SsOAH; hejmara gihîştina GenBank: XM_001590428.1) di mîkeliya Sclerotinia sclerotiorum de hate bikar anîn. Bi kurtasî, S. sclerotiorum di şûşeyek ku PDB tê de hebû de hate derzîkirin û di înkubatorek hejandinê de (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) di 25 ± 2 °C de ji bo 24 demjimêran bi 150 rpm û di tariyek domdar de (24 demjimêr) hate danîn da ku mezinbûna mîkeliyê were teşwîq kirin. Piştre, hucre bi L-ornîtîn û fungîsîda Rizolex-T di konsantrasyonên dawîn ên IC50 de (bi rêzê ve bi qasî 40 û 3.2 mg/L) hatin dermankirin û dûv re di bin heman mercan de ji bo 24 demjimêrên din hatin çandin. Piştî înkubasyonê, kultur bi 2500 rpm bo 5 deqeyan hatin santrifujkirin û madeya sergirtî (mîselyûma fungî) ji bo analîza îfadeya genê hat berhevkirin. Bi heman awayî, mîselyûma fungî di 0, 24, 48, 72, 96 û 120 demjimêran piştî enfeksiyonê ji nebatan vegirtî yên ku li ser rûyê tevnên vegirtî qalibê spî û mîselyûma pembû çêkirine, hat berhevkirin. RNA ji mîselyûma fungî hat derxistin û dûv re cDNA wekî ku li jor hatî vegotin hat sentezkirin. Rêzên primer ji bo SsOAH di Tabloya Pêvek S3 de hatine navnîş kirin. SsActin (hejmara gihîştina GenBank: XM_001589919.1) wekî gena malê hat bikar anîn, û îfadeya genê ya têkildar bi karanîna rêbaza 2-ΔΔCT hat hesabkirin (Livak û Schmittgen, 2001).
Asîda oksalîk di ava dekstroza kartol (PDB) û nimûneyên nebatan de ku patojena fungî Sclerotinia sclerotiorum tê de heye, li gorî rêbaza Xu û Zhang (2000) bi guhertinên piçûk hat destnîşankirin. Bi kurtasî, îzolasyonên S. sclerotiorum di şûşeyên ku PDB tê de hene de hatin derzîkirin û dûv re di înkubatorek hejandinê de (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) bi 150 rpm di 25 ± 2 °C de ji bo 3-5 rojan di tariyek domdar de (24 demjimêr) hatin çandin da ku mezinbûna mîselyûmê were teşwîqkirin. Piştî înkubasyonê, çanda fungî pêşî bi rêya kaxeza fîlterê ya Whatman #1 hate parzûnkirin û dûv re bi 2500 rpm ji bo 5 hûrdeman ji bo rakirina mîselyûma mayî hate santrifûjkirin. Ji bo diyarkirina hejmarî ya bêtir a oksalatê, madeyên sergirtî hatin berhevkirin û di 4°C de hatin hilanîn. Ji bo amadekirina nimûneyên nebatan, bi qasî 0.1 g perçeyên tevna nebatan sê caran bi ava distilkirî (her carê 2 ml) hatin derxistin. Piştre nimûne bi 2500 rpm bo 5 deqeyan hatin santrifujkirin, madeya sergirtî bi rêya kaxiza fîlterê ya Whatman No. 1 bi hişkî hate fîltrekirin û ji bo analîza bêtir hate berhevkirin.
Ji bo analîza hejmarî ya asîda oksalîk, tevliheviya reaksiyonê di lûleyek cam a bi tap de bi rêza jêrîn hate amadekirin: 0.2 ml nimûne (an jî fîltrata çanda PDB an jî çareseriya standard a asîda oksalîk), 0.11 ml şînê bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 ml asîda sulfurîk a 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Qahîre, Misir) û 0.176 ml dîkromata potasyûmê ya 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), û dû re çareserî bi ava distilkirî heta 4.8 ml hate şilkirin, bi tundî hate tevlihevkirin û di cih de di hemamek avê ya 60 °C de hate danîn. Piştî 10 hûrdeman, reaksiyon bi zêdekirina 0.5 ml çareseriya hîdroksîda sodyûmê (NaOH; 0.75 M) hate rawestandin. Vegirtin (A600) ya tevliheviya reaksiyonê di 600 nm de bi karanîna spektrofotometreyek UV-160 (Shimadzu Corporation, Japonya) hate pîvandin. PDB û ava distilkirî wekî kontrol ji bo pîvandina filtratên çandiniyê û nimûneyên nebatan, bi rêzê ve, hatin bikar anîn. Têkeliyên asîda oksalîk di filtratên çandiniyê de, ku wekî mîkrogramên asîda oksalîk li ser mîlîlîtreyek navgîniya PDB (μg.mL−1) û di ekstraktên pelan de, ku wekî mîkrogramên asîda oksalîk li ser gram giraniya teze (μg.g−1 FW) têne diyar kirin, bi karanîna xêza kalibrkirina asîda oksalîk (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) hatin destnîşankirin.
Di tevahiya lêkolînê de, hemû ceribandin bi sêwiraneke bi temamî rasthatî (CRD) bi şeş dubarekirinên biyolojîk ji bo her dermankirinê û pênc kûz ji bo her dubarekirina biyolojîk (du nebat ji bo her kûz) hatine sêwirandin, heya ku nehatibe diyarkirin. Dubarekirinên biyolojîk bi du caran hatin analîzkirin (du dubarekirinên teknîkî). Dubarekirinên teknîkî ji bo kontrolkirina dubarebûna heman ceribandinê hatin bikar anîn lê di analîza îstatîstîkî de nehatin bikar anîn da ku ji dubarekirinên sexte dûr bikevin. Daneyên bi karanîna analîza guherbariyê (ANOVA) û dûv re jî testa cudahiya girîng a Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0.05) bi îstatîstîkî hatin analîzkirin. Ji bo ceribandinên in vitro, nirxên IC50 û IC99 bi karanîna modela probit hatin hesabkirin û navberên baweriyê yên 95% hatin hesabkirin.
Bi tevahî çar îzolasyon ji zeviyên soya yên cuda li Parêzgeha El Ghabiya, Misir hatin berhevkirin. Li ser navgîna PDA, hemî îzolasyonan mîselyûma spî ya kremî çêkirin ku zû bû spî ya pembû (Wêne 1A) û dûv re di qonaxa sklerotîyûmê de bej an qehweyî bû. Sklerotî bi gelemperî tîr, reş, gilover an jî bi şiklê nerêkûpêk in, 5.2 heta 7.7 mm dirêj û 3.4 heta 5.3 mm di qûtra wan de ne (Wêne 1B). Her çend çar îzolasyonan piştî 10-12 rojên înkubasyonê li 25 ± 2 °C qalibek marjînal a sklerotîayê li qiraxa navgîna çandiniyê pêş xistin (Wêne 1A), hejmara sklerotîayê li ser plakayê di navbera wan de bi girîngî cûda bû (P < 0.001), ku îzolasyona 3 xwedî hejmara herî zêde ya sklerotîayê bû (32.33 ± 1.53 sklerotî li ser plakayê; Wêne 1C). Bi heman awayî, îzolekirina #3 di PDB de ji îzolekirinên din bêtir asîda oksalîk hilberand (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Wêne 1D). Îzoleya #3 taybetmendiyên morfolojîk û mîkroskopîk ên tîpîk ên fungusa fîtopatojen Sclerotinia sclerotiorum nîşan da. Mînakî, li ser PDA, koloniyên îzolekirina #3 bi lez mezin bûn, spîya kremî bûn (Wêne 1A), bejê berevajî an zer-qehweyîya somonê ya vekirî, û 6-7 rojan di 25 ± 2°C de hewce kir da ku rûyê plakaya bi qutra 9 cm bi tevahî veşêrin. Li gorî taybetmendiyên morfolojîk û mîkroskopîk ên jorîn, îzolekirina #3 wekî Sclerotinia sclerotiorum hate nas kirin.
Wêne 1. Taybetmendî û patogenîtiya îzolasyonên S. sclerotiorum ji berhemên nîskên hevpar. (A) Mezinbûna mîselî ya çar îzolasyonên S. sclerotiorum li ser navgîna PDA, (B) sklerotiya çar îzolasyonên S. sclerotiorum, (C) hejmara sklerotiyayan (li ser her plakê), (D) derdana asîda oksalîk li ser navgîna PDB (μg.mL−1), û (E) giraniya nexweşiyê (%) ya çar îzolasyonên S. sclerotiorum li ser cureya nîskên bazirganî ya hesas Giza 3 di bin şert û mercên serayê de. Nirx navînî ± SD ya pênc dubarekirinên biyolojîkî temsîl dikin (n = 5). Tîpên cûda cûdahiyên girîng ên îstatîstîkî di navbera dermanan de nîşan didin (p < 0.05). (F–H) Nîşanên tîpîk ên qalibê spî li ser stûn û silîkên jorîn, bi rêzê ve, 10 roj piştî derzîkirinê bi îzolasyona #3 (dpi) xuya bûn. (I) Analîza pêşketinî ya herêma spacera transkrîpsiyonkirî ya navxweyî (ITS) ya îzoleya S. sclerotiorum #3 bi karanîna rêbaza îhtîmala herî zêde hate kirin û bi 20 îzole/şaneyên referansê yên ku ji databasa Navenda Neteweyî ya Agahdariya Biyoteknolojiyê (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) hatine wergirtin re hate berhev kirin. Hejmarên li jor xetên komkirinê firehiya herêmê (%) nîşan didin, û hejmarên li jêr xetên komkirinê dirêjahiya şaxê nîşan didin.
Herwiha, ji bo piştrastkirina nexweşîbûnê, çar îzolekirinên S. sclerotiorum ên hatine bidestxistin ji bo derzîkirina cureya fasûlyeya bazirganî ya hesas Giza 3 di bin şert û mercên serayê de hatin bikar anîn, ku ev yek bi postulatên Koch re lihevhatî ye (Wêne 1E). Her çend hemî îzolekirinên fungî yên hatine bidestxistin nexweşî bûn û dikarin fasûlyeya kesk (cv. Giza 3) enfeksiyon bikin, û di 10 rojan piştî derzîkirinê (dpi) de li ser hemî beşên jorîn (Wêne 1F), nemaze li ser qurm (Wêne 1G) û qalikan (Wêne 1H) nîşanên tîpîk ên qaliba spî çêbibin jî, îzolekirina 3 di du ceribandinên serbixwe de îzolekirina herî êrîşkar bû. Îzoleya 3 li ser nebatan giraniya nexweşiyê (%) ya herî bilind hebû (bi rêzê ve 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, û 76.7 ± 3.1 di 7, 14, û 21 rojan piştî enfeksiyonê de; Wêne 1F).
Nasnameya îzoleya S. sclerotiorum #3 ya herî dagirker li ser bingeha rêzkirina spacer a transkrîpsiyona navxweyî (ITS) hate piştrast kirin (Wêne 1I). Analîza fîlojenetîk di navbera îzoleya #3 û 20 îzole/şaneyên referansê de dişibiya bilind (>99%) di navbera wan de nîşan da. Hêjayî gotinê ye ku îzoleya S. sclerotiorum #3 (533 bp) dişibihe îzoleya S. sclerotiorum LPM36 ya Amerîkî ku ji tovên nokên hişk (hejmara gihîştina GenBank MK896659.1; 540 bp) û îzoleya S. sclerotiorum ya Çînî YKY211 (hejmara gihîştina GenBank OR206374.1; 548 bp), ku dibe sedema rizîna stûna binefşî (Matthiola incana), ku hemî li jorê dendrogramê ji hev cuda têne kom kirin (Wêne 1I). Rêzeya nû di databasa NCBI de hatiye danîn û bi navê "Sclerotinia sclerotiorum – îzole YN-25" (Hejmara gihîştina GenBank PV202792) hatiye binavkirin. Diyar e ku îzole 3 îzoleya herî dagirker e; ji ber vê yekê, ev îzole ji bo lêkolînê di hemî ceribandinên paşîn de hat hilbijartin.
Çalakiya antîbakteriyal a dîamîn L-ornîtîn (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya) di konsantrasyonên cuda de (12.5, 25, 50, 75, 100 û 125 mg/L) li dijî îzoleya S. sclerotiorum 3 di vitro de hate lêkolîn kirin. Girîng e ku L-ornîtîn bandorek antîbakteriyal nîşan da û hêdî hêdî mezinbûna radyal a hîfayên S. sclerotiorum bi awayekî girêdayî dozê asteng kir (Wêne 2A, B). Di konsantrasyona herî bilind a ceribandî de (125 mg/L), L-ornîtîn rêjeya astengkirina mezinbûna mîkelî ya herî bilind nîşan da (99.62 ± 0.27%; Wêne 2B), ku di konsantrasyona herî bilind a ceribandî de (10 mg/L) wekhevî fungîsîda bazirganî Rizolex-T bû (rêjeya astengkirinê 99.45 ± 0.39%; Wêne 2C), ku bandorek wekhev nîşan dide.
Wêne 2. Çalakiya antîbakteriyal a L-ornîtînê ya li dijî Sclerotinia sclerotiorum di vitro de. (A) Berawirdkirina çalakiya antîbakteriyal a konsantrasyonên cûda yên L-ornîtînê li dijî S. sclerotiorum bi fungîsîda bazirganî Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Rêjeya astengkirinê (%) ya mezinbûna mîkelî ya S. sclerotiorum piştî dermankirinê bi konsantrasyonên cûda yên L-ornîtînê (12.5, 25, 50, 75, 100 û 125 mg/L) an Rizolex-T (2, 4, 6, 8 û 10 mg/L), bi rêzê ve. Nirx navînî ± SD ya pênc dubarekirinên biyolojîkî temsîl dikin (n = 5). Tîpên cûda cûdahiyên îstatîstîkî di navbera dermanan de nîşan didin (p < 0.05). (D, E) Analîza regresyona modela Probit a L-ornîtînê û fungîsîda bazirganî Rizolex-T, bi rêzê ve. Xeta regresyona modela probit wekî xêzek şîn a yekgirtî tê nîşandan, û navbera baweriyê (95%) wekî xêzek sor a xalxalî tê nîşandan.
Herwiha, analîza regresyona probit hate kirin û nexşeyên têkildar di Tabloya 1 û Wêneyên 2D,E de têne nîşandan. Bi kurtasî, nirxa meyldariya qebûlkirî (y = 2.92x − 4.67) û statîstîkên girîng ên têkildar (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 û p < 0.0001; Wêne 2D) ya L-ornîtînê çalakiyek dijî-fungî ya zêde li dijî S. sclerotiorum li gorî fungîsîda bazirganî Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 û p < 0.0001) nîşan da (Tabloya 1).
Tabloya 1. Nirxên nîv-herî zêde ya konsantrasyona astengker (IC50) û IC99 (mg/l) ya L-ornîtîn û fungîsîda bazirganî "Rizolex-T" li dijî S. sclerotiorum.
Bi tevayî, L-ornîtîn (250 mg/L) li ser nebatên fasûlyeya hevpar ên dermankirî li gorî nebatên bi S. sclerotiorum vegirtî yên nehatine dermankirin (kontrol; Wêne 3A) pêşketin û giraniya qaliba spî bi girîngî kêm kir. Bi kurtasî, her çend giraniya nexweşiyê ya nebatên kontrolê yên vegirtî yên nehatine dermankirin hêdî hêdî zêde bû (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, û 92.33 ± 3.06%), L-ornîtîn di tevahiya ceribandinê de bi girîngî giraniya nexweşiyê (%) kêm kir (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, û 26.36 ± 3.07) di 7, 14 û 21 rojan piştî dermankirinê (dpt) de, bi rêzê ve (Wêne 3A). Bi heman awayî, dema ku nebatên fasûliyê yên bi S. sclerotiorum vegirtî bi 250 mg/L L-ornîtîn hatin dermankirin, qada di bin xêza pêşveçûna nexweşiyê de (AUDPC) ji 1274.33 ± 33.13 di kontrola bê dermankirin de daket 281.03 ± 7.95, ku ji ya kontrola erênî 50 mg/L fungîsîda Rizolex-T (183.61 ± 7.71; Wêne 3B) hinekî kêmtir bû. Di ceribandina duyemîn de jî heman meyl hate dîtin.
Wêne 3. Bandora sepandina eksojen a L-ornîtînê li ser pêşketina rizîna spî ya fasûlyeya asayî ya ji ber Sclerotinia sclerotiorum di şert û mercên serayê de. (A) Xêza pêşketina nexweşiyê ya qaliba spî ya fasûlyeya asayî piştî dermankirina bi 250 mg/L L-ornîtînê. (B) Rûbera di bin xêza pêşketina nexweşiyê (AUDPC) ya qaliba spî ya fasûlyeya asayî piştî dermankirina bi L-ornîtînê. Nirx navînî ± SD ya pênc dubarekirinên biyolojîkî temsîl dikin (n = 5). Tîpên cûda cûdahiyên girîng ên îstatîstîkî di navbera dermanan de nîşan didin (p < 0.05).
Bikaranîna eksojen a 250 mg/L L-ornîtînê piştî 42 rojan hêdî hêdî bilindahiya nebatan (Wêne 4A), hejmara şaxên li ser nebatan (Wêne 4B), û hejmara pelên li ser nebatan (Wêne 4C) zêde kir. Her çend fungîsîda bazirganî Rizolex-T (50 mg/L) bandora herî mezin li ser hemî parametreyên xurekî yên lêkolînkirî hebû jî, bikaranîna eksojen a 250 mg/L L-ornîtînê li gorî kontrolên bê dermankirin bandora duyemîn a herî mezin hebû (Wêne 4A–C). Ji hêla din ve, dermankirina L-ornîtînê bandorek girîng li ser naveroka pîgmentên fotosentezê klorofîl a (Wêne 4D) û ​​klorofîl b (Wêne 4E) nekir, lê naveroka tevahî ya karotenoidê (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) li gorî kontrola neyînî (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) û kontrola erênî (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Wêne 4F) hinekî zêde kir. Bi tevayî, ev encam nîşan didin ku L-ornîtîn ji bo nîskên dermankirî ne fîtotoksîk e û dibe ku mezinbûna wan teşwîq bike.
Wêne 4. Bandora sepandina L-ornîtînê ya eksojen li ser taybetmendiyên mezinbûnê û rengdêrên fotosentezê yên pelên fasûliyê yên bi Sclerotinia sclerotiorum vegirtî di şert û mercên serayê de. (A) Bilindahiya nebatê (cm), (B) Hejmara şaxan li ser her nebatê, (C) Hejmara pelan li ser her nebatê, (D) Naveroka klorofîl a (mg g-1 fr wt), (E) Naveroka klorofîl b (mg g-1 fr wt), (F) Naveroka tevahî ya karotenoidê (mg g-1 fr wt). Nirx navînî ± SD ya pênc dubarekirinên biyolojîkî ne (n = 5). Tîpên cûda cûdahiyên girîng ên îstatîstîkî di navbera dermanan de nîşan didin (p < 0.05).
Cihêkirina hîstokîmyayî ya di cîh de ya cureyên oksîjenê yên reaktîf (ROS; wekî hîdrojen peroksît [H2O2] tê îfadekirin) û radîkalên azad (wekî anyonên superoksît [O2•−] têne îfadekirin) eşkere kir ku sepandina eksojen a L-ornîtîn (250 mg/L) kombûna H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Wêne 5A) û O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Wêne 5B) li gorî kombûna hem nebatan vegirtî yên nehatine dermankirin (bi rêzê ve 173.31 ± 12.06 û 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) û hem jî nebatan ku bi 50 mg/L fungîsîda bazirganî Rizolex-T (bi rêzê ve 170.12 ± 9.50 û 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt) hatine dermankirin di 72 demjimêran de bi girîngî kêm kir. Asta bilind a H2O2 û O2•− di bin hpt de kom bûn (Wêne 5A, B). Bi heman awayî, ceribandina malondialdehyde (MDA) ya li ser bingeha TCA nîşan da ku nebatên fasûliyê yên bi S. sclerotiorum vegirtî di pelên xwe de astên bilindtir ên MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) kom kirin (Wêne 5C). Lêbelê, sepandina eksojen a L-ornîtîn peroksîdasyona lîpîdan bi girîngî kêm kir, wekî ku bi kêmbûna naveroka MDA di nebatên dermankirî de (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) ve hatî îsbat kirin.
Wêne 5. Bandora sepandina L-ornîtînê ya eksojen li ser nîşankerên sereke yên stresa oksîdatîf û mekanîzmayên parastina antîoksîdan ên ne-enzîmatîk di pelên fasûliyê yên bi S. sclerotiorum vegirtî de di 72 demjimêran piştî enfeksiyonê de di bin şert û mercên serayê de. (A) Hîdrojen peroksît (H2O2; nmol g−1 FW) li 72 hpt, (B) anyona superoksîd (O2•−; nmol g−1 FW) li 72 hpt, (C) malondialdehîd (MDA; nmol g−1 FW) li 72 hpt, (D) tevahî fenolên çareserker (mg GAE g−1 FW) li 72 hpt, (E) tevahî flavonoîdên çareserker (mg RE g−1 FW) li 72 hpt, (F) tevahî asîdên amînî yên azad (mg g−1 FW) li 72 hpt, û (G) naveroka prolînê (mg g−1 FW) li 72 hpt. Nirx navînî ± devîasyona standard (navînî ± SD) ya 5 dubarekirinên biyolojîkî (n = 5) temsîl dikin. Tîpên cuda cudahiyên girîng ên îstatîstîkî di navbera dermanan de nîşan didin (p < 0.05).