Me berê ragihandibû ku asta serumê ya metabolîta trîptofanê ya ji rûvî hatî wergirtin asîda îndol-3-propîonîk (IPA) di nexweşên bi fîbroza kezebê de kêmtir e. Di vê lêkolînê de, me transkriptom û DNA metîloma di kezebên qelew de di têkiliya bi asta IPA ya serumê de, û her weha rola IPA di çêkirina neçalakkirina fenotipîk a hucreyên stellate yên kezebê (HSC) de li vitro lêkolîn kir.
Lêkolînê 116 nexweşên qelew bêyî şekirê tîpa 2 (T2DM) (temen 46.8 ± 9.3 sal; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) ku li Navenda Emeliyata Barîyatrîk a Kuopio (KOBS) emeliyata barîyatrîk derbas kirin, di nav xwe de girt. Asta IPA ya di gera xwînê de bi kromatografiya şile-spektrometriya girseyî (LC-MS) hate pîvandin, analîza transkriptoma kezebê bi rêzkirina RNA ya tevahî hate kirin, û analîza metîlasyona DNA-yê bi karanîna Infinium HumanMethylation450 BeadChip hate kirin. Hucreyên stellate yên kezebê yên mirovî (LX-2) ji bo ceribandinên in vitro hatin bikar anîn.
Asta IPA ya serumê bi îfadeya genên ku di rêyên apoptotîk, mîtofajîk û temendirêjiyê yên di kezebê de beşdar in re têkildar bû. Gena AKT serîn/treonîn kînaz 1 (AKT1) di profîlên metîlasyona DNA û transkrîptên kezebê de gena herî zêde û serdest a têkiliyê bû. Dermankirina IPA bi modulkirina îfadeya genên ku tê zanîn ku fîbroz, apoptoz û zindîmana xaneyên LX-2 rêk dixin, apoptoz çêkir, nefesgirtina mîtokondrî kêm kir, û morfolojiya xaneyê û dînamîkên mîtokondrî guherand.
Bi hev re, ev daneyên han piştgirî didin wê baweriyê ku IPA bandorên dermankirinê yên potansiyel heye û dikare apoptozê teşwîq bike û fenotipa HSC ber bi rewşek neçalak ve biguhezîne, bi vî awayî îhtîmala astengkirina fîbroza kezebê bi destwerdana çalakkirina HSC û metabolîzma mîtokondrî berfireh dike.
Belavbûna qelewbûn û sendroma metabolîk bi zêdebûna bûyerên nexweşiya kezeba rûn a bi metabolîzma ve girêdayî (MASLD) ve girêdayî ye; nexweşî bandorê li %25 heta %30ê nifûsa giştî dike [1]. Encama sereke ya etiolojiya MASLD fîbroza kezebê ye, pêvajoyek dînamîk e ku bi kombûna domdar a matrîksa fîbroz a derveyî hucreyê (ECM) ve tête diyar kirin [2]. Hucreyên sereke yên ku di fîbroza kezebê de beşdar in hucreyên stêrkî yên hepatîk (HSC) ne, ku çar fenotipên naskirî nîşan didin: bêçalak, çalakkirî, neçalakkirî, û pîrbûyî [3, 4]. HSC dikarin werin çalak kirin û ji formek bêçalak veguherînin hucreyên mîna fîbroblast ên pirjimar ên bi daxwazên enerjiyê yên bilind, bi zêdebûna îfadeya aktîna masûlkeya nerm a α (α-SMA) û kolajena celeb I (Col-I) [5, 6]. Di dema berevajîkirina fîbroza kezebê de, HSC-yên çalakkirî bi rêya apoptozê an neçalakkirinê têne ji holê rakirin. Ev pêvajo kêmkirina genên fîbrojenîk û modûlasyona genên prosozivalî (wek rêyên sînyala NF-κB û PI3K/Akt) [7, 8], û her weha guhertinên di dînamîk û fonksiyona mîtokondrî de vedihewîne [9].
Asta serumê ya metabolîta trîptofanê asîda îndol-3-propîonîk (IPA), ku di rûvî de tê hilberandin, di nexweşiyên metabolîk ên mirovan de, tevî MASLD, kêm bûye [10-13]. IPA bi vexwarina fîbera xwarinê ve girêdayî ye, bi bandorên xwe yên antîoksîdan û antî-înflamatuar tê zanîn, û fenotipa steatohepatîta ne-alkolîk (NASH) ya ji ber parêzê di vivo û in vitro de kêm dike [11-14]. Hin delîl ji lêkolîna me ya berê tên, ku nîşan da ku asta serumê ya IPA di nexweşên bi fîbroza kezebê de ji nexweşên qelew ên bêyî fîbroza kezebê di Lêkolîna Emeliyata Barîyatrîk a Kuopio (KOBS) de kêmtir bû. Wekî din, me nîşan da ku dermankirina IPA dikare îfadeya genên ku nîşankerên klasîk ên girêdana hucreyê, koçberiya hucreyê û çalakkirina hucreyên stûna hematopoietîk di modela hucreya stellate ya kezebê ya mirovan (LX-2) de ne kêm bike û metabolîtek potansiyel a parastina kezebê ye [15]. Lêbelê, ne diyar e ka IPA çawa bi çalakkirina apoptoza HSC û biyoenergetîka mîtokondrî regresyona fîbroza kezebê teşwîq dike.
Li vir, em nîşan didin ku IPA ya serumê bi îfadeya genên dewlemendkirî di rêyên apoptozê, mîtofajiyê û temendirêjiyê de di kezeba kesên qelew lê ne bi diyabetesa tîpa 2 (KOBS) ve girêdayî ye. Wekî din, me dît ku IPA dikare bi rêya rêya neçalakkirinê paqijkirin û hilweşandina hucreyên bingehîn ên hematopoietîk ên çalakkirî (HSC) teşwîq bike. Ev encam roleke nû ji bo IPA eşkere dikin, ku wê dike hedefeke dermankirinê ya potansiyel ji bo pêşvebirina paşveçûna fîbroza kezebê.
Lêkolîneke berê ya di koma KOBS de nîşan da ku nexweşên bi fîbroza kezebê li gorî nexweşên bê fîbroza kezebê asta IPA ya di xwînê de kêmtir bû [15]. Ji bo ku bandora tevlihev a potansiyel a diyabetesa tîpa 2 were derxistin, me 116 nexweşên qelew bêyî diyabetesa tîpa 2 (temenê navînî ± SD: 46.8 ± 9.3 sal; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Tabloya 1) ji lêkolîna KOBS ya berdewam wekî nifûsa lêkolînê tomar kir [16]. Hemî beşdaran razîbûna agahdar a nivîskî dan û protokola lêkolînê ji hêla Komîteya Etîkê ya Nexweşxaneya Wîlayeta Savo ya Bakur ve li gorî Danezana Helsînkî (54/2005, 104/2008 û 27/2010) hate pejirandin.
Nimûneyên biyopsiya kezebê di dema emeliyata barîyatrîk de hatin wergirtin û ji hêla patologên xwedî ezmûn ve li gorî pîvanên ku berê hatine vegotin bi awayekî hîstolojîk hatin nirxandin [17, 18]. Pîvanên nirxandinê di Tabloya Pêvek S1 de hatine kurtkirin û berê jî hatine vegotin [19].
Nimûneyên seruma rojîgirtinê bi karanîna kromatografiya şilek a bêarmanc-spektrometriya girseyî (LC-MS) ji bo analîza metabolomîkê (n = 116) hatin analîzkirin. Nimûne bi karanîna pergala UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Almanya) wekî ku berê hatiye vegotin hatin analîzkirin19. Nasnameya alkola îzopropîl (IPA) li ser bingeha dema ragirtinê û berhevdana spektruma MS/MS bi standardên paqij hate kirin. Di hemî analîzên din de şiddeta sînyala IPA (qada lûtkeyê) hate hesibandin [20].
Rêzkirina RNA ya tevahiya kezebê bi karanîna Illumina HiSeq 2500 hate kirin û daneyên wekî ku berê hatiye vegotin pêş-proses kirin [19, 21, 22]. Me analîza îfadeya cûda ya hedefgirtî ya transkrîptên ku bandorê li fonksiyon/biyogeneza mîtokondrî dikin bi karanîna 1957 genên ku ji databasa MitoMiner 4.0 hatine hilbijartin pêk anî [23]. Analîza metîlasyona DNAya kezebê bi karanîna Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) bi karanîna heman rêbaza ku berê hatiye vegotin hate kirin [24, 25].
Hucreyên stellate yên kezeba mirovan (LX-2) ji hêla Prof. Stefano Romeo ve bi dilxwazî ​​​​hatin peyda kirin û di navgîna DMEM/F12 de hatin çandin û parastin (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Ji bo hilbijartina doza xebatê ya IPA, hucreyên LX-2 bi konsantrasyonên cûda yên IPA (10 μM, 100 μM û 1 mM; Sigma, 220027) di navgîna DMEM/F12 de ji bo 24 demjimêran hatin dermankirin. Wekî din, ji bo lêkolîna şiyana IPA ya bêçalakkirina HSC-yan, hucreyên LX-2 bi 5 ng/ml TGF-β1 (sîstemên R&D, 240-B-002/CF) û 1 mM IPA di navgîna bê serum de ji bo 24 demjimêran hatin hev-dermankirin. Ji bo kontrolên wesayîtên têkildar, 4 nM HCL ku ji %0.1 BSA tê de heye ji bo dermankirina TGF-β1 û ji %0.05 DMSO ji bo dermankirina IPA hat bikar anîn, û her du jî bi hev re ji bo dermankirina tevlihev hatin bikar anîn.
Apoptoz li gorî rêwerzên çêker bi karanîna Kîta Tesbîtkirina Apoptozê ya FITC Annexin V bi 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) hate nirxandin. Bi kurtasî, LX-2 (1 × 105 hucre/çal) di tevahiya şevê de di plakayên 12-çal de hate çandin û dûv re bi dozên pirjimar ên IPA an IPA û TGF-β1 hate dermankirin. Roja din, hucreyên şemitok û pêvekirî hatin berhevkirin, trîpsîn kirin, bi PBS hatin şuştin, di tampona girêdana Annexin V de ji nû ve hatin sekinandin, û bi FITC-Annexin V û 7-AAD re ji bo 15 hûrdeman hatin înkubasyon kirin.
Mîtokondriyên di hucreyên zindî de ji bo çalakiya oksîdatîf bi karanîna Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) hatin boyaxkirin. Ji bo ceribandinên MTR, hucreyên LX-2 bi densiteyên wekhev bi IPA û TGF-β1 hatin înkubasyonkirin. Piştî 24 demjimêran, hucreyên zindî hatin trîpsînkirin, bi PBS hatin şuştin, û dûv re bi 100 μM MTR di navgînek bê serum de li 37 °C ji bo 20 hûrdeman wekî ku berê hatiye vegotin hatin înkubasyonkirin [26]. Ji bo analîza morfolojiya hucreyên zindî, mezinahiya hucreyê û tevliheviya sîtoplazmayî bi karanîna parametreyên belavbûna pêş (FSC) û belavbûna alî (SSC) hatin analîzkirin.
Hemû daneyên (30,000 bûyer) bi karanîna NovoCyte Quanteon (Agilent) hatin berhevkirin û bi karanîna nermalava NovoExpress® 1.4.1 an FlowJo V.10 hatin analîzkirin.
Rêjeya xerckirina oksîjenê (OCR) û rêjeya asîdkirina derveyî hucreyê (ECAR) bi karanîna Analyzerek Fluksa Derveyî Hucreyê ya Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ku bi Seahorse XF Cell Mito Stress ve li gorî rêwerzên çêker ve hatî sazkirin, di wextê rast de hatin pîvandin. Bi kurtasî, 2 × 104 hucreyên LX-2/bîr li ser plakayên çandina hucreyê yên XF96 hatin çandin. Piştî înkubasyona şevekê, hucrey bi îzopropanol (IPA) û TGF-β1 (Rêbazên Pêvek 1) hatin dermankirin. Analîza daneyan bi karanîna nermalava Seahorse XF Wave, ku Generatorê Rapora Testa Fenotîpa Enerjiya Hucreya Seahorse XF vedihewîne, hate kirin. Ji vê yekê, Indeksa Tenduristiya Biyoenerjîk (BHI) hate hesabkirin [27].
RNAya giştî bo cDNAyê hat veguhastin. Ji bo rêbazên taybetî, li referansa [15] binêre. Astên mRNA yên proteîna asîdî ya rîbozomal a 60S ya mirovî P0 (RPLP0) û sîklofîlîn A1 (PPIA) wekî kontrolên genê yên damezrîner hatin bikar anîn. Pergala PCR ya Dem-rast a QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Hollanda) bi TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) an Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) re hat bikar anîn, û qata îfadeya genê ya têkildar bi karanîna parametreyên çerxerêya nirxa Ct ya berawirdî (ΔΔCt) û rêbaza ΔΔCt hat hesab kirin. Hûrguliyên primeran di Tabloyên Pêvek S2 û S3 de têne peyda kirin.
DNAya navokî (ncDNA) û DNAya mîtokondrî (mtDNA) bi karanîna kîta xwînê û tevnê ya DNeasy (Qiagen) wekî ku berê hatiye vegotin [28] hatin derxistin. Mîqdara nisbî ya mtDNA bi hesabkirina rêjeya her herêma mtDNA ya hedef bi navînîya geometrîkî ya sê herêmên DNAya navokî (mtDNA/ncDNA) re, wekî ku di Rêbazên Pêvek 2 de bi berfirehî hatiye destnîşan kirin, hate hesab kirin. Hûrguliyên primerên ji bo mtDNA û ncDNA di Tabloya Pêvek S4 de têne peyda kirin.
Xaneyên zindî bi Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) hatin boyaxkirin da ku torên mîtokondrî yên navxaneyî û navxaneyî werin dîtin. Xaneyên LX-2 (1 × 104 xane/bîr) li ser slaytên cam di plakayên çandiniyê yên binê cam ên têkildar de hatin çandin (Ibidi GmbH, Martinsried, Almanya). Piştî 24 demjimêran, xaneyên zindî yên LX-2 bi 100 μM MTR bo 20 hûrdeman li 37°C hatin înkubasyonkirin û navikên xaneyan bi DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) wekî ku berê hatiye vegotin hatin boyaxkirin [29]. Torên mîtokondrî bi karanîna mîkroskopa berevajîkirî ya Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Almanya) ku bi moduleke konfokal a Zeiss LSM 800 ve di 37°C de di atmosferek şilkirî de bi 5% CO2 bi karanîna objektîfek 63×NA 1.3 ve hatî çêkirin, hatin dîtin. Me ji bo her celebê nimûneyê deh wêneyên rêzeya Z bi dest xistin. Her rêzeya Z 30 beş hene, her yek bi qalindahiya 9.86 μm. Ji bo her nimûneyekê, wêneyên deh qadên dîtinê yên cûda bi karanîna nermalava ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Almanya) hatin girtin, û analîza morfolojiya mîtokondrî bi karanîna nermalava ImageJ (v1.54d) [30, 31] li gorî parametreyên ku di Rêbazên Pêvek 3 de bi hûrgulî hatine destnîşan kirin, hate kirin.
Xane bi 2% glutaraldehyde di tampona fosfatê ya 0.1 M de hatin sabît kirin, dû re bi çareseriya 1% osmium tetroxide (Sigma Aldrich, MO, USA) hatin sabît kirin, hêdî hêdî bi aseton (Merck, Darmstadt, Almanya) hatin zuhakirin, û di dawiyê de di rezîna epoksî de hatin bicihkirin. Beşên pir zirav hatin amadekirin û bi 1% uranîl asetat (Merck, Darmstadt, Almanya) û 1% sîtrat serşokê (Merck, Darmstadt, Almanya) hatin boyaxkirin. Wêneyên ultrastrûktûrî bi karanîna mîkroskopa elektronîkî ya veguhestinê ya JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Japonya) bi voltaja lezkirinê ya 80 kV hatin bidestxistin.
Morfolojiya şaneyên LX-2 yên ku bi IPA ji bo 24 demjimêran hatine dermankirin, bi mîkroskopiya kontrast-fazê bi mezinkirina 50x bi karanîna mîkroskopa ronahiya berevajîkirî ya Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 û AxioCam MRm, Jena, Almanya) hate analîzkirin.
Daneyên klînîkî wekî navînî ± devîasyona standard an medyan (range interquartile: IQR) hatin îfadekirin. Analîza yekalî ya guherînê (guhêrbarên domdar) an testa χ² (guhêrbarên kategorîk) ji bo berhevdana cûdahiyên di navbera sê komên lêkolînê de hatin bikar anîn. Rêjeya erênî ya derewîn (FDR) ji bo rastkirina ceribandina pirjimar hate bikar anîn, û genên bi FDR < 0.05 wekî girîngên îstatîstîkî hatin hesibandin. Analîza koralasyona Spearman ji bo girêdana metîlasyona DNA ya CpG bi şîdeta sînyala IPA re hate bikar anîn, bi nirxên p yên nominal (p < 0.05) hatin ragihandin.
Analîza rêyê bi karanîna amûrek analîzkirina seta genan a li ser webê (WebGestalt) ji bo 268 transkriptan (p nominal < 0.01), 119 transkriptên bi mîtokondriyê ve girêdayî (p nominal < 0.05), û 4350 CpG ji 3093 transkriptên kezebê yên ku bi asta IPA ya serumê ya di nav xwînê de ve girêdayî bûn, hate kirin. Amûra Venny DB (guhertoya 2.1.0) ya belaş ji bo dîtina genên hevgirtî hate bikar anîn, û StringDB (guhertoya 11.5) ji bo dîtbarîkirina têkiliyên proteîn-proteîn hate bikar anîn.
Ji bo ceribandina LX-2, nimûne bi karanîna testa D'Agostino-Pearson ji bo normalbûnê hatin ceribandin. Daneyên ji herî kêm sê dubarekirinên biyolojîk hatin wergirtin û bi testa post hoc ya Bonferroni re ANOVA-ya yekalî hatin derbaskirin. Nirxa p-yê ya ji 0.05 kêmtir wekî girîng a îstatîstîkî hate hesibandin. Daneyên wekî navînî ± SD têne pêşkêş kirin, û hejmara ceribandinan di her şeklê de tê destnîşan kirin. Hemî analîz û grafîk bi karanîna nermalava îstatîstîkî ya GraphPad Prism 8 ji bo Windows-ê (GraphPad Software Inc., guhertoya 8.4.3, San Diego, USA) hatin kirin.
Pêşî, me têkiliya asta IPA ya serumê bi transkriptên kezeb, tevahiya laş û mîtokondrî ve lêkolîn kir. Di profîla transkriptê ya giştî de, gena herî bihêz a ku bi asta IPA ya serumê ve girêdayî ye MAPKAPK3 bû (FDR = 0.0077; proteîn kînaza çalakkirî ya mîtokondrî - proteîn kînaza çalakkirî 3); di profîla transkriptê ya têkildarî mîtokondrî de, gena herî bihêz a têkildar AKT1 bû (FDR = 0.7621; AKT serîn/treonîn kînaza 1) (Dosyaya Zêde 1 û Dosyaya Zêde 2).
Piştre me transkrîptên gerdûnî (n = 268; p < 0.01) û transkrîptên bi mîtokondriyê ve girêdayî (n = 119; p < 0.05) analîz kirin, û di dawiyê de apoptoz wekî rêya kanonîk a herî girîng destnîşan kir (p = 0.0089). Ji bo transkrîptên mîtokondriyê yên bi asta IPA ya serumê ve girêdayî, me li ser apoptozê (FDR = 0.00001), mîtofajî (FDR = 0.00029), û rêyên sînyala TNF (FDR = 0.000006) sekinî (Wêne 1A, Tabloya 2, û Wêneyên Pêvek 1A-B).
Analîza hevberdanê ya transkrîptên gerdûnî, yên bi mîtokondriyê ve girêdayî, û metilasyona DNAyê di kezeba mirovan de bi têkiliya bi asta IPA ya serumê re. A 268 transkrîptên gerdûnî, 119 transkrîptên bi mîtokondriyê ve girêdayî, û transkrîptên metilkirî yên DNAyê temsîl dike ku bi 3092 cihên CpG yên bi asta IPA ya serumê ve girêdayî ne (nirxên p < 0.01 ji bo transkrîptên gerdûnî û DNAya metilkirî, û nirxên p < 0.05 ji bo transkrîptên mîtokondriyê). Transkrîptên sereke yên hevberdanê di navîn de têne nîşandan (AKT1 û YKT6). B Nexşeya têkiliyê ya 13 genên bi puana têkiliyê ya herî bilind (0.900) bi genên din re ji 56 genên hevberdanê (herêma xeta reş) ku bi girîngî bi asta IPA ya serumê ve girêdayî bûn, bi karanîna amûra serhêl StringDB hate çêkirin. Kesk: Genên ku bi pêkhateya hucreyî ya Ontolojiya Genê (GO) ve hatine nexşandin: mîtokondrî (GO:0005739). AKT1 proteîna ku li ser bingeha daneyan (li ser bingeha lêkolîna nivîsê, ceribandin, database û hev-îfadekirinê) ji bo têkiliyên bi proteînên din re xwedî puana herî bilind (0.900) e. Girêkên torê proteînan temsîl dikin, û qirax jî girêdanên di navbera proteînan de temsîl dikin.
Ji ber ku metabolîtên mîkrobiotaya rûvî dikarin pêkhateya epîgenetîk bi rêya metîlasyona DNAyê rêk bixin [32], me lêkolîn kir ka asta IPA ya serumê bi metîlasyona DNAya kezebê ve girêdayî ye an na. Me dît ku du cihên sereke yên metîlasyonê yên ku bi asta IPA ya serumê ve girêdayî ne nêzîkî herêma 3 ya dewlemend bi prolîn-serîn (C19orf55) û endamê malbata proteîna şoka germê B (biçûk) 6 (HSPB6) bûn (Dosyaya zêde 3). Metîlasyona DNA ya 4350 CpG (p < 0.01) bi asta IPA ya serumê ve girêdayî bû û di rêyên rêkxistina temendirêjiyê de dewlemend bû (p = 0.006) (Wêne 1A, Tabloya 2, û Wêneya Pêvek 1C).
Ji bo têgihîştina mekanîzmayên biyolojîk ên di bin têkiliyên di navbera astên IPA yên serumê, transkrîptên gerdûnî, transkrîptên bi mîtokondriyê ve girêdayî, û metîlasyona DNAyê di kezeba mirovan de, me analîzek hevgirtinê ya genên ku di analîza rêça berê de hatine destnîşankirin pêk anî (Wêne 1A). Encamên analîza dewlemendkirina rêça 56 genên hevgirtî (di hundurê xeta reş a di Wêne 1A de) nîşan da ku rêça apoptozê (p = 0.00029) du genên hevpar ên sê analîzan ronî kir: AKT1 û YKT6 (homologa YKT6 v-SNARE), wekî ku di diyagrama Venn de tê xuyang kirin (Wêneya Pêvek 2 û Wêne 1A). Bi balkêşî, me dît ku AKT1 (cg19831386) û YKT6 (cg24161647) bi astên IPA yên serumê re bi awayekî erênî têkildar bûn (Dosyeya Zêde 3). Ji bo destnîşankirina têkiliyên potansiyel ên proteînê di navbera hilberên genan de, me 13 genên bi puana herêma hevpar a herî bilind (0.900) di nav 56 genên hevgirtî de wekî têketin hilbijartin û nexşeyek têkiliyê ava kir. Li gorî asta baweriyê (baweriya marjînal), gena AKT1 bi puana herî bilind (0.900) li jor bû (Wêne 1B).
Li gorî analîza rêyê, me dît ku apoptoz rêya sereke bû, ji ber vê yekê me lêkolîn kir ka dermankirina IPA dê bandorê li apoptoza HSC-yan bike an na. Me berê nîşan da ku dozên cûda yên IPA (10 μM, 100 μM, û 1 mM) ji bo şaneyên LX-2 ne-jehrî bûn [15]. Vê lêkolînê nîşan da ku dermankirina IPA bi 10 μM û 100 μM hejmara şaneyên zindî û nekrotîk zêde kir. Lêbelê, li gorî koma kontrolê, zindîbûna şaneyê di konsantrasyona IPA ya 1 mM de kêm bû, lê rêjeya nekroza şaneyê bêguherîn ma (Wêne 2A, B). Piştre, ji bo dîtina konsantrasyona çêtirîn ji bo teşwîqkirina apoptozê di şaneyên LX-2 de, me 10 μM, 100 μM, û 1 mM IPA ji bo 24 demjimêran ceriband (Wêne 2A-E û Wêneya Pêvek 3A-B). Balkêş e ku IPA 10 μM û 100 μM rêjeya apoptozê (%) kêm kir, lêbelê, IPA 1 mM li gorî kontrola apoptoza dereng û rêjeya apoptozê (%) zêde kir û ji ber vê yekê ji bo ceribandinên din hate hilbijartin (Wêne 2A-D).
IPA apoptoza şaneyên LX-2 çalak dike. Rêbaza boyaxkirina ducarî ya Annexin V û 7-AAD ji bo pîvandina rêjeya apoptozê û morfolojiya şaneyan bi sîtometriya herikînê hate bikar anîn. Şaneyên BA bi 10 μM, 100 μM û 1 mM IPA ji bo 24 demjimêran an jî bi F–H TGF-β1 (5 ng/ml) û 1 mM IPA di navgînek bê serum de ji bo 24 demjimêran hatin înkubasyon kirin. A: şaneyên zindî (Annexin V -/ 7AAD-); B: şaneyên nekrotîk (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: zû (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: dereng (Annexin V+/7AAD.+); E, H: rêjeya tevahî şaneyên apoptozê yên zû û dereng di rêjeya apoptozê de (%). Daneyên wekî navînî ± SD, n = 3 ceribandinên serbixwe têne îfade kirin. Berawirdkirinên îstatîstîkî bi karanîna ANOVA-ya yekalî bi testa Bonferroni post hoc hatin kirin. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Wekî ku me berê nîşan da, 5 ng/ml TGF-β1 dikare bi zêdekirina îfadeya genên nîşanker ên klasîk çalakkirina HSC teşwîq bike [15]. Hucreyên LX-2 bi 5 ng/ml TGF-β1 û 1 mM IPA bi hev re hatin dermankirin (Wêne 2E-H). Dermankirina TGF-β1 rêjeya apoptozê neguherand, lêbelê, dermankirina hev-IPA rêjeya apoptoza dereng û rêjeya apoptozê (%) li gorî dermankirina TGF-β1 zêde kir (Wêne 2E-H). Ev encam nîşan didin ku 1 mM IPA dikare apoptozê di hucreyên LX-2 de serbixwe ji teşwîqkirina TGF-β1 pêşve bibe.
Me bandora IPA li ser bêhnvedana mîtokondrî di hucreyên LX-2 de bêtir lêkolîn kir. Encam nîşan dan ku 1 mM IPA parametreyên rêjeya xerckirina oksîjenê (OCR) kêm kir: bêhnvedana ne-mîtokondrî, bêhnvedana bingehîn û herî zêde, rijandina protonê û hilberîna ATP li gorî koma kontrolê (Wêne 3A, B), di heman demê de endeksa tenduristiya biyoenerjîk (BHI) neguherî.
IPA di hucreyên LX-2 de bêhnvedana mîtokondrî kêm dike. Xêza bêhnvedana mîtokondrî (OCR) wekî parametreyên bêhnvedana mîtokondrî (bêhnvedana ne-mîtokondrî, bêhnvedana bingehîn, bêhnvedana herî zêde, rijandina protonê, çêbûna ATP, SRC û BHI) tê pêşkêş kirin. Hucreyên A û B bi rêzê ve bi 10 μM, 100 μM û 1 mM IPA ji bo 24 demjimêran hatin înkubasyon kirin. Hucreyên C û D bi rêzê ve bi TGF-β1 (5 ng/ml) û 1 mM IPA di navgînek bê serum de ji bo 24 demjimêran hatin înkubasyon kirin. Hemî pîvandin bi karanîna kîta CyQuant li gorî naveroka DNA-yê hatin normalîzekirin. BHI: endeksa tenduristiya biyoenerjîk; SRC: kapasîteya rezerva bêhnvedanê; OCR: rêjeya xerckirina oksîjenê. Daneyên wekî navînî ± devîasyona standard (SD) têne pêşkêş kirin, n = 5 ceribandinên serbixwe. Berawirdkirinên îstatîstîkî bi karanîna ANOVA-ya yek-alî û testa Bonferroni ya post hoc hatin kirin. *p < 0.05; **p < 0.01; û ***p < 0.001
Ji bo têgihîştineke berfirehtir a bandora IPA li ser profîla biyoenerjîk a şaneyên LX-2 yên bi TGF-β1-çalakkirî, me fosforîlasyona oksîdatîf a mîtokondrî bi OCR-ê analîz kir (Wêne 3C,D). Encam nîşan dan ku dermankirina TGF-β1 dikare bêhnvedana herî zêde, kapasîteya rezerva bêhnvedanê (SRC) û BHI li gorî koma kontrolê kêm bike (Wêne 3C,D). Wekî din, dermankirina hevbeş bêhnvedana bingehîn, rijandina proton û hilberîna ATP kêm kir, lê SRC û BHI ji yên ku bi TGF-β1-ê hatine dermankirin bi girîngî bilindtir bûn (Wêne 3C,D).
Me "Testa Fenotîpa Enerjiya Hucreyî" jî ku ji hêla nermalava Seahorse ve hatî peyda kirin pêk anî (Wêneya Pêvek 4A-D). Wekî ku di Wêneya Pêvek 3B de tê xuyang kirin, potansiyelên metabolîk ên hem OCR û hem jî ECAR piştî dermankirina TGF-β1 kêm bûn, lêbelê, di komên dermankirina tevlihev û IPA de li gorî koma kontrolê ti cûdahî nehat dîtin. Wekî din, hem asta bingehîn û hem jî asta stresê ya OCR piştî dermankirina tevlihev û IPA li gorî koma kontrolê kêm bûn (Wêneya Pêvek 4C). Balkêş e ku şêwazek wekhev bi terapiya tevlihev re hate dîtin, ku li wir di asta bingehîn û stresê ya ECAR de li gorî dermankirina TGF-β1 ti guherînek nehat dîtin (Wêneya Pêvek 4C). Di HSC-yan de, kêmkirina fosforîlasyona oksîdatîf a mîtokondrî û şiyana dermankirina tevlihev ji bo sererastkirina SCR û BHI piştî rûbirûbûna dermankirina TGF-β1 potansiyela metabolîk (OCR û ECAR) neguherand. Bi hev re, ev encam nîşan didin ku IPA dikare biyoenergetîka di HSC-an de kêm bike, ev yek jî nîşan dide ku IPA dikare profîlek enerjîk a nizmtir çêbike ku fenotipa HSC ber bi bêçalakbûnê ve diguhezîne (Wêneya Pêvek 4D).
Bandora IPA li ser dînamîkên mîtokondrî bi karanîna pîvandina sê-alî ya morfolojiya mîtokondrî û girêdanên torê û her weha boyaxkirina MTR hate lêkolîn kirin (Wêne 4 û Wêneya Pêvek 5). Wêne 4 nîşan dide ku, li gorî koma kontrolê, dermankirina TGF-β1 rûbera navîn, hejmara şaxan, dirêjahiya giştî ya şaxan, û hejmara girêdana şaxan kêm kir (Wêne 4A û B) û rêjeya mîtokondrî ji morfolojiya sferîk ber bi morfolojiya navîn guherand (Wêne 4C). Tenê dermankirina IPA qebareya navîn a mîtokondrî kêm kir û rêjeya mîtokondrî ji morfolojiya sferîk ber bi morfolojiya navîn guherand li gorî koma kontrolê (Wêne 4A). Berevajî vê, sferîkîtî, dirêjahiya navîn a şaxan, û çalakiya mîtokondrî ku ji hêla MTR-ya girêdayî potansiyela membrana mîtokondrî ve hatî nirxandin (Wêne 4A û E) neguherî man û ev parametre di navbera koman de cûda nebûn. Bi hev re, ev encam nîşan didin ku dermankirina TGF-β1 û IPA xuya dike ku şekil û mezinahiya mîtokondrî û her weha tevliheviya torê di hucreyên LX-2 yên zindî de modûl dikin.
IPA dînamîkên mîtokondrî û pirbûna DNA-ya mîtokondrî di hucreyên LX-2 de diguherîne. A. Wêneyên konfokal ên nûner ên hucreyên zindî yên LX-2 bi TGF-β1 (5 ng/ml) û 1 mM IPA ji bo 24 demjimêran di navgînek bê serum de hatine înkubasyon kirin ku torên mîtokondrî yên bi Mitotracker™ Red CMXRos û navikên bi DAPI şîn hatine boyaxkirin nîşan didin. Hemî daneyan herî kêm 15 wêne ji bo her komekê hebûn. Me ji bo her celebê nimûneyê 10 wêneyên Z-stack bi dest xistin. Her rêza Z-eksenê 30 perçe dihewîne, her yek bi qalindahiya 9.86 μm. Şêweya pîvanê: 10 μm. B. Tiştên nûner (tenê mîtokondrî) bi sepandina eşika adapteyî li ser wêneyê hatine destnîşankirin. Analîza hejmarî û berawirdkirina girêdanên tora morfolojîk a mîtokondrî ji bo hemî hucreyên di her komê de hatin kirin. C. Frekansa rêjeyên şeklê mîtokondrî. Nirxên nêzîkî 0 şeklên sferîk nîşan didin, û nirxên nêzîkî 1 şeklên fîlamentoz nîşan didin. D Naveroka DNAya mîtokondrî (mtDNA) wekî ku di Materyal û Rêbazan de hatiye vegotin hate destnîşankirin. E Analîza Mitotracker™ Red CMXRos bi sîtometrîya herikînê (30,000 bûyer) wekî ku di Materyal û Rêbazan de hatiye vegotin hate kirin. Daneyên wekî navînî ± SD, n = 3 ceribandinên serbixwe têne pêşkêş kirin. Berawirdkirinên îstatîstîkî bi karanîna ANOVA-ya yekalî û testa Bonferroni ya post hoc hatin kirin. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Piştre me naveroka mtDNA di hucreyên LX-2 de wekî nîşaneyek jimara mîtokondrî analîz kir. Li gorî koma kontrolê, naveroka mtDNA di koma ku bi TGF-β1 hatiye dermankirin de zêde bû (Wêne 4D). Li gorî koma ku bi TGF-β1 hatiye dermankirin, naveroka mtDNA di koma dermankirina tevlihev de kêm bû (Wêne 4D), ku ev yek nîşan dide ku IPA dikare naveroka mtDNA û dibe ku hejmara mîtokondrî û her weha nefesgirtina mîtokondrî kêm bike (Wêne 3C). Wekî din, xuya bû ku IPA naveroka mtDNA di dermankirina tevlihev de kêm dike lê bandor li çalakiya mîtokondrî ya bi navbeynkariya MTR nekiriye (Wêne 4A–C).
Me têkiliya IPA bi asta mRNA ya genên ku bi fîbroz, apoptoz, saxman û dînamîkên mîtokondrî ve girêdayî ne di hucreyên LX-2 de lêkolîn kir (Wêne 5A–D). Li gorî koma kontrolê, koma ku bi TGF-β1 hatiye dermankirin, zêdebûna îfadeya genên wekî zincîra α2 ya kolajenê ya celeb I (COL1A2), aktîna masûlkeya nerm a α (αSMA), metalloproteînaza matrîksê 2 (MMP2), astengkerê tevnê yê metalloproteînaza 1 (TIMP1), û gena dişibihe dînamîn 1 (DRP1) nîşan da, ku nîşan dide ku fîbroz û aktîvasyon zêde bûye. Wekî din, li gorî koma kontrolê, dermankirina bi TGF-β1 asta mRNA ya reseptora pregnane X ya navokî (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, astengkerê hucreya B α, zêdekerê peptîda sivik a gena faktora navokî κ (NFκB1A), û astengkerê jêr-yekîneya kînaza faktora navokî κB β (IKBKB) kêm kir (Wêne 5A–D). Li gorî dermankirina TGF-β1, dermankirina hevbeş bi TGF-β1 û IPA re derbirîna COL1A2 û MMP2 kêm kir, lê asta mRNA ya PXR, TIMP1, lîmfoma hucreya B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, û IKBKB zêde kir. Dermankirina bi IPA derbirîna MMP2, proteîna X ya girêdayî Bcl-2 (BAX), AKT1, proteîna atrofiya optîk 1 (OPA1), û proteîna hevgirtina mîtokondrî 2 (MFN2) bi girîngî kêm kir, lê derbirîna CASP8, NFκB1A, NFκB1B, û IKBKB li gorî koma kontrolê zêde bû. Lêbelê, di derbirîna caspase-3 (CASP3), faktora çalakkirina peptîdaza apoptotîk 1 (APAF1), proteîna hevgirtina mîtokondrî 1 (MFN1), û proteîna fîsyon 1 (FIS1) de ti cûdahî nehat dîtin. Bi hev re, ev encam nîşan didin ku dermankirina IPA îfadeya genên ku bi fîbroz, apoptoz, saxman û dînamîkên mîtokondrî ve girêdayî ne diguherîne. Daneyên me nîşan didin ku dermankirina IPA fîbrozê di hucreyên LX-2 de kêm dike; di heman demê de, ew bi guheztina fenotipê ber bi bêçalakbûnê ve saxmanan teşwîq dike.
IPA îfadeya genên fîbroblast, apoptotîk, jiyanbarî, û dînamîkên mîtokondrî di hucreyên LX-2 de modûl dike. Hîstogram îfadeya mRNA-yê ya li gorî kontrola endojîn (RPLP0 an PPIA) piştî ku hucreyên LX-2 bi TGF-β1 û IPA di navgînek bê serum de ji bo 24 demjimêran hatin çalakirin nîşan didin. A fîbroblastan nîşan dide, B hucreyên apoptotîk nîşan dide, C hucreyên saxmayî nîşan dide, û D îfadeya gena dînamîkên mîtokondrî nîşan dide. Daneyên wekî navînî ± devîasyona standard (SD), n = 3 ceribandinên serbixwe têne pêşkêş kirin. Berawirdkirinên îstatîstîkî bi karanîna ANOVA-ya yek-alî û testa Bonferroni ya post hoc hatin kirin. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Paşê, guhertinên di mezinahiya şaneyan de (FSC-H) û tevliheviya sîtoplazmayî (SSC-H) bi sîtometriya herikînê hatin nirxandin (Wêne 6A,B), û guhertinên di morfolojiya şaneyan de piştî dermankirina IPA bi mîkroskopiya elektrona veguhastinê (TEM) û mîkroskopiya kontrastê ya qonaxê hatin nirxandin (Wêneya Pêvek 6A-B). Wekî ku tê hêvîkirin, şaneyên di koma ku bi TGF-β1 hatiye dermankirin de li gorî koma kontrolê (Wêne 6A,B) di mezinahiyê de zêde bûn, ku berfirehbûna klasîk a retîkuluma endoplazmayî ya xav (ER*) û fagolîzozom (P) nîşan dide, ku çalakbûna şaneya stûna hematopoietîk (HSC) nîşan dide (Wêneya Pêvek 6A). Lêbelê, li gorî koma ku bi TGF-β1 hatiye dermankirin, mezinahiya şaneyan, tevliheviya sîtoplazmayî (Wêne 6A,B), û naveroka ER* di koma dermankirina bi kombînasyona TGF-β1 û IPA de kêm bûn (Wêneya Pêvek 6A). Herwiha, dermankirina bi IPA mezinahiya şaneyê, tevliheviya sîtoplazmayî (Wêne 6A, B), naveroka P û ER* (Wêneya Pêvek 6A) li gorî koma kontrolê kêm kir. Wekî din, naveroka şaneyên apoptotîk piştî 24 demjimêran dermankirina IPA li gorî koma kontrolê zêde bû (tîrên spî, Wêneya Pêvek 6B). Bi hev re, ev encam nîşan didin ku 1 mM IPA dikare apoptoza HSC teşwîq bike û guhertinên di parametreyên morfolojîk ên şaneyê de ku ji hêla TGF-β1 ve têne çêkirin berevajî bike, bi vî rengî mezinahiya şaneyê û tevliheviya wê rêk dixe, ku dibe ku bi neçalakkirina HSC ve girêdayî be.
IPA mezinahiya şaneyan û tevliheviya sîtoplazmayî di şaneyên LX-2 de diguherîne. Wêneyên temsîlkar ên analîza sîtometrîya herikînê. Analîzê stratejiyeke derîkirinê ya taybetî ji bo şaneyên LX-2 bi kar anî: SSC-A/FSC-A ji bo destnîşankirina nifûsa şaneyan, FSC-H/FSC-A ji bo destnîşankirina dubletan, û SSC-H/FSC-H ji bo analîza mezinahiya şaneyan û tevliheviya wan. Şane bi TGF-β1 (5 ng/ml) û 1 mM IPA di navgîna bê serum de ji bo 24 demjimêran hatin înkubekirin. Şaneyên LX-2 ji bo analîza mezinahiya şaneyan û tevliheviya sîtoplazmayî li çaryeka çepê ya jêrîn (SSC-H-/FSC-H-), çaryeka çepê ya jorîn (SSC-H+/FSC-H-), çaryeka rastê ya jêrîn (SSC-H-/FSC-H+), û çaryeka rastê ya jorîn (SSC-H+/FSC-H+) hatin belavkirin. B. Morfolojiya şaneyê bi sîtometriya herikînê bi karanîna FSC-H (belavbûna pêş, mezinahiya şaneyê) û SSC-H (belavbûna alî, tevliheviya sîtoplazmayî) (30,000 bûyer) hate analîzkirin. Daneyên wekî navînî ± SD, n = 3 ceribandinên serbixwe têne pêşkêş kirin. Berawirdkirinên îstatîstîkî bi karanîna ANOVA-ya yekalî û testa Bonferroni ya post hoc hatin kirin. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 û ****p < 0.0001
Metabolîtên rûvî yên wekî IPA bûne mijarek germ a lêkolînê, ku ev yek nîşan dide ku dibe ku hedefên nû di mîkrobiotaya rûvî de werin kifş kirin. Ji ber vê yekê balkêş e ku IPA, metabolîtek ku me bi fîbroza kezebê di mirovan de girêdaye [15], di modelên heywanan de wekî pêkhateyek potansiyel a antî-fîbrotîk hatiye nîşandan [13, 14]. Li vir, em cara yekem têkiliyek di navbera IPA ya serum û transkrîptomîkên kezebê yên gerdûnî û metilasyona DNA-yê di kesên qelew de bêyî diyabetesa tîpa 2 (T2D) nîşan didin, ku apoptoz, mîtofajî û temendirêjiyê, û her weha genek namzed a gengaz AKT1 ku homeostaza kezebê rêk dixe ronî dike. Nûbûnek din a lêkolîna me ev e ku me têkiliya dermankirina IPA bi apoptoz, morfolojiya hucreyê, biyoenergetîka mîtokondrî û dînamîkên di hucreyên LX-2 de nîşan da, ku spektrumek enerjiyê ya kêmtir nîşan dide ku fenotipa HSC ber bi neçalakbûnê ve diguhezîne, IPA dike namzedek potansiyel ji bo baştirkirina fîbroza kezebê.
Me dît ku apoptoz, mîtofajî û temendirêjî rêyên kanonîk ên herî girîng bûn ku di genên kezebê de dewlemend bûne ku bi IPA-ya seruma di gera xwînê de ne. Têkçûna pergala kontrola kalîteya mîtokondrî (MQC) dikare bibe sedema bêserûberiya mîtokondrî, mîtofajî û apoptozê, bi vî rengî pêşveçûna MASLD-ê pêş dixe [33, 34]. Ji ber vê yekê, em dikarin texmîn bikin ku IPA dibe ku di parastina dînamîkên hucreyê û yekparebûna mîtokondrî de bi rêya apoptoz, mîtofajî û temendirêjiyê di kezebê de beşdar be. Daneyên me nîşan dan ku du gen di nav sê ceribandinan de hevpar bûn: YKT6 û AKT1. Hêjayî gotinê ye ku YKT6 proteînek SNARE ye ku di pêvajoya yekbûna membrana hucreyê de beşdar e. Ew bi çêkirina kompleksek destpêkirinê bi STX17 û SNAP29 re li ser otofagozomê rolek di otofajî û mîtofajiyê de dilîze, bi vî rengî yekbûna otofagozom û lîzozoman pêş dixe [35]. Herwiha, windakirina fonksiyona YKT6 dibe sedema kêmbûna mîtofajiyê [36], di heman demê de zêdebûna YKT6 bi pêşveçûna karsînoma hucreya kezebê (HCC) ve girêdayî ye, ku zêdebûna jiyana hucreyê nîşan dide [37]. Ji aliyekî din ve, AKT1 gena herî girîng a têkiliyê ye û di nexweşiyên kezebê de rolek girîng dilîze, di nav de rêça sînyala PI3K/AKT, çerxa hucreyê, koçberiya hucreyê, zêdebûn, girêdana fokal, fonksiyona mîtokondrî, û derdana kolajenê [38-40]. Rêça sînyala PI3K/AKT ya aktîvkirî dikare hucreyên stûna hematopoietîk (HSC) aktîv bike, ku hucreyên berpirsiyarê hilberîna matrîksa derveyî hucreyê (ECM) ne, û nerêkûpêkkirina wê dibe ku beşdarî çêbûn û pêşveçûna fîbroza kezebê bibe [40]. Wekî din, AKT yek ji faktorên sereke yên jiyana hucreyê ye ku apoptoza hucreya girêdayî p53 asteng dike, û aktîvkirina AKT dibe ku bi astengkirina apoptoza hucreya kezebê ve girêdayî be [41, 42]. Encamên hatine bidestxistin nîşan didin ku IPA dibe ku bi bandorkirina biryara hepatosîtan di navbera ketina apoptozê an jî mayîndebûnê de di apoptoza girêdayî mîtokondriya kezebê de beşdar be. Ev bandor dikarin ji hêla genên namzet ên AKT û/an YKT6 ve werin rêkxistin, ku ji bo homeostaza kezebê girîng in.
Encamên me nîşan dan ku 1 mM IPA di hucreyên LX-2 de bêyî dermankirina TGF-β1 apoptoz çêkir û nefesgirtina mîtokondrî kêm kir. Hêjayî gotinê ye ku apoptoz rêyek sereke ye ji bo çareserkirina fîbrozê û çalakkirina hucreyên reh ên hematopoietîk (HSC), û di heman demê de bûyerek sereke ye di bersiva fîzyolojîk a berevajî ya fîbroza kezebê de [4, 43]. Wekî din, vegerandina BHI di hucreyên LX-2 de piştî dermankirina hevbeş têgihiştinên nû li ser rola potansiyel a IPA di rêkxistina biyoenerjiya mîtokondrî de peyda kir. Di bin şert û mercên bêhnvedan û neçalak de, hucreyên hematopoietîk bi gelemperî fosforîlasyona oksîdatîf a mîtokondrî bikar tînin da ku ATP hilberînin û çalakiya metabolîk a kêm heye. Ji hêla din ve, çalakkirina HSC nefesgirtin û bîyosenteza mîtokondrî zêde dike da ku hewcedariyên enerjiyê yên ketina rewşa glîkolîtîk telafî bike [44]. Rastiya ku IPA bandor li potansiyela metabolîk û ECAR nekir, nîşan dide ku rêça glîkolîtîk kêmtir pêşîn e. Bi heman awayî, lêkolînek din nîşan da ku 1 mM IPA dikare çalakiya zincîra respirasyonê ya mîtokondrî di kardiyomîyosîtan, xeta şaneya hepatosîta mirovan (Huh7) û şaneyên endotelyal ên vena umbîlîkal a mirovan (HUVEC) de modûl bike; Lêbelê, ti bandora IPA li ser glîkolîzê di kardiyomîyosîtan de nehat dîtin, ku ev yek nîşan dide ku IPA dikare bandorê li biyoenergetîka celebên şaneyên din bike [45]. Ji ber vê yekê, em texmîn dikin ku 1 mM IPA dikare wekî veqetînerek kîmyewî ya nerm tevbigere, ji ber ku ew dikare îfadeya gena fîbrojenîk, morfolojiya şaneyê û biyoenergetîka mîtokondrî bêyî ku mîqdara mtDNA biguhezîne bi girîngî kêm bike [46]. Veqetînerên mîtokondrî dikarin fîbroza ji hêla çandê ve hatî çêkirin û çalakkirina HSC asteng bikin [47] û hilberîna ATP ya mîtokondrî kêm bikin ku ji hêla hin proteînan ve wekî proteînên veqetandinê (UCP) an translokaza nukleotîd a adenîn (ANT) ve tê rêvebirin an jî têne çêkirin. Li gorî celebê şaneyê, ev diyarde dikare şaneyan ji apoptozê biparêze û/an apoptozê pêş bixe [46]. Lêbelê, lêkolînên din hewce ne ji bo ronîkirina rola IPA wekî veqetînerek mîtokondrî di neçalakkirina hucreyên reh ên hematopoietîk de.
Piştre me lêkolîn kir ka guhertinên di nefesgirtina mîtokondrî de di morfolojiya mîtokondrî de di hucreyên LX-2 yên zindî de têne xuyang kirin an na. Bi balkêşî, dermankirina TGF-β1 rêjeya mîtokondrî ji sferîk ber bi navîn diguherîne, bi kêmbûna şaxbûna mîtokondrî û zêdebûna îfadeya DRP1, faktorek sereke di dabeşbûna mîtokondrî de [48]. Wekî din, perçebûna mîtokondrî bi tevliheviya torê ya giştî ve girêdayî ye, û veguheztina ji hevgirtinê ber bi dabeşbûnê ji bo çalakkirina hucreya reh a hematopoietîk (HSC) girîng e, lê astengkirina dabeşbûna mîtokondrî dibe sedema apoptoza HSC [49]. Bi vî rengî, encamên me nîşan didin ku dermankirina TGF-β1 dikare bibe sedema kêmbûna tevliheviya tora mîtokondrî bi kêmbûna şaxbûnê, ku di dabeşbûna mîtokondrî de ku bi hucreyên reh ên hematopoietîk ên çalakkirî (HSC) ve girêdayî ye, gelemperîtir e. Wekî din, daneyên me nîşan dan ku IPA dikare rêjeya mîtokondrî ji şeklê sferîk ber bi navîn biguhezîne, bi vî rengî îfadeya OPA1 û MFN2 kêm dike. Lêkolînan nîşan dane ku kêmkirina OPA1 dikare bibe sedema kêmbûna potansiyela membrana mîtokondrî û apoptoza hucreyê bide destpêkirin [50]. MFN2 bi navbeynkariya hevgirtina mîtokondrî û apoptozê tê zanîn [51]. Encamên hatine bidestxistin nîşan didin ku çalakkirina hucreyên LX-2 ji hêla TGF-β1 û/an IPA ve xuya dike ku şekil û mezinahiya mîtokondrî, û her weha rewşa çalakkirinê û tevliheviya torê diguherîne.
Encamên me nîşan didin ku dermankirina hevbeş a TGFβ-1 û IPA dikare bi rêkxistina îfadeya mRNA ya fîbrozê, apoptozê û genên têkildarî zindîbûnê di xaneyên dûrketina ji apoptozê de, parametreyên mtDNA û morfolojiya xaneyê kêm bike. Bi rastî, IPA asta îfadeya mRNA ya AKT1 û genên girîng ên fîbrozê yên wekî COL1A2 û MMP2 kêm kir, lê asta îfadeya CASP8, ku bi apoptozê ve girêdayî ye, zêde kir. Encamên me nîşan dan ku piştî dermankirina IPA, îfadeya BAX kêm bû û îfadeya mRNA ya yekîneyên malbata TIMP1, BCL-2 û NF-κB zêde bû, ku ev yek nîşan dide ku IPA dikare sînyalên zindîbûnê di xaneyên bineretî yên hematopoietîk (HSC) de teşwîq bike ku ji apoptozê direvin. Ev molekul dikarin wekî sînyalên pro-zindîbûnê di xaneyên bineretî yên hematopoietîk ên çalakkirî de tevbigerin, ku dibe ku bi zêdebûna îfadeya proteînên dij-apoptotîk (wek Bcl-2), kêmbûna îfadeya BAX ya pro-apoptotîk, û têkiliyek tevlihev di navbera TIMP û NF-κB de ve girêdayî be [5, 7]. IPA bandorên xwe bi rêya PXR nîşan dide, û me dît ku dermankirina hevbeş bi TGF-β1 û IPA re asta derbirîna mRNA ya PXR zêde kir, ku nîşan dide ku çalakkirina HSC tê tepeserkirin. Tê zanîn ku sînyala PXR ya çalakkirî çalakkirina HSC hem di vivo û hem jî di vitro de asteng dike [52, 53]. Encamên me nîşan didin ku IPA dikare bi pêşvebirina apoptozê, kêmkirina fîbroz û metabolîzma mîtokondrî, û zêdekirina sînyalên zindîbûnê, ku pêvajoyên tîpîk in ku fenotipa HSC ya çalakkirî vediguherînin fenotipek neçalakkirî, di paqijkirina HSC-yên çalakkirî de beşdar bibe. Şiroveyek din a gengaz ji bo mekanîzmaya potansiyel û rola IPA di apoptozê de ev e ku ew mîtokondriyên nefonksiyonel bi giranî bi rêya mîtofajiyê (rêya hundurîn) û rêya sînyala TNF ya derveyî (Tabloya 1), ku rasterast bi rêya sînyala zindîbûnê ya NF-κB ve girêdayî ye (Wêneya Pêvek 7), paqij dike. Balkêş e ku genên dewlemendkirî yên bi IPA-yê ve girêdayî dikarin di rêça apoptozê de sînyalên pro-apoptotîk û pro-zindîbûnê teşwîq bikin [54], ku ev yek nîşan dide ku IPA dikare rêça apoptotîk an jî zindîbûnê bi têkiliya bi van genan re teşwîq bike. Lêbelê, ka IPA çawa apoptoz an jî zindîbûnê di dema çalakkirina HSC de teşwîq dike û rêyên wê yên mekanîstîk hîn ne diyar in.
IPA metabolîteke mîkrobî ye ku ji trîptofana xwarinê bi rêya mîkrobiotaya rûvî çêdibe. Lêkolînan nîşan daye ku di hawîrdora rûvî de xwedî taybetmendiyên dijî-înflamatuar, antîoksîdan û rêziknameya epîgenetîk e.[55] Lêkolînan nîşan daye ku IPA dikare fonksiyona astengiya rûvî modûl bike û stresa oksîdatîf kêm bike, ku dibe ku beşdarî bandorên wê yên fîzyolojîk ên herêmî bibe.[56] Bi rastî, IPA bi rêya gera xwînê ber bi organên hedef ve tê veguhastin, û ji ber ku IPA avahiyek metabolîta sereke ya mîna trîptofan, serotonin û derivatîfên îndolê parve dike, IPA çalakiyên metabolîk pêk tîne ku di encamê de çarenûsa metabolîk a reqabetê çêdike.[52] IPA dikare bi metabolîtên ji trîptofanê hatine wergirtin re ji bo cihên girêdanê li ser enzîm an receptoran re pêşbaziyê bike, ku potansiyel rêyên metabolîk ên normal têk dide. Ev hewcedariya lêkolînên din li ser farmakokînetîk û farmakodînamîka wê ronî dike da ku pencereya wê ya dermankirinê çêtir were fam kirin.[57] Hîn nayê dîtin ka ev dikare di hucreyên bineretî yên hematopoietîk (HSC) de jî çêbibe.
Em qebûl dikin ku lêkolîna me hin sînorkirin hene. Ji bo ku em bi taybetî têkiliyên têkildarî IPA-yê lêkolîn bikin, me nexweşên bi diyabetesa tîpa 2 (T2DM) derxistin. Em qebûl dikin ku ev sepandina berfireh a dîtinên me ji bo nexweşên bi diyabetesa tîpa 2 û nexweşiya kezebê ya pêşketî sînordar dike. Her çend rêjeya fîzyolojîk a IPA di seruma mirovan de 1-10 μM be [11, 20], rêjeya 1 mM IPA li gorî rêjeya herî bilind a ne-jehrî [15] û rêjeya herî bilind a apoptozê hat hilbijartin, bêyî ku di rêjeya nifûsa hucreyên nekrotîk de cûdahî hebe. Her çend astên suprafîzyolojîk ên IPA di vê lêkolînê de hatin bikar anîn jî, niha di derbarê doza bi bandor a IPA-yê de lihevkirinek tune [52]. Her çend encamên me girîng bin jî, çarenûsa metabolîk a berfirehtir a IPA qadeke lêkolînê ya çalak dimîne. Wekî din, dîtinên me li ser têkiliya di navbera astên IPA-ya serumê û metîlasyona DNA-yê ya transkrîptên kezebê de ne tenê ji hucreyên stûna hematopoietîk (HSC) lê di heman demê de ji şaneyên kezebê jî hatin bidestxistin. Me li ser bingeha dîtinên xwe yên berê ji analîza transkrîptomê ku IPA bi çalakkirina hucreya reh a hematopoietîk (HSC) ve girêdayî ye [15], û HSC hucreyên sereke ne ku di pêşveçûna fîbroza kezebê de beşdar in. Kezeb ji gelek celebên hucreyan pêk tê, ji ber vê yekê modelên hucreyên din ên wekî pergala hev-çandina hucreya hepatosît-HSC-parastinê ya bi çalakkirina kaspaz û parçekirina DNA-yê re û her weha mekanîzmaya çalakiyê ya di nav de asta proteînê divê ji bo lêkolîna rola IPA û têkiliya wê bi celebên din ên hucreyên kezebê re werin hesibandin.