Rêzkirina proteînan di rêça veşartinê de ji bo parastina dabeşkirina şaneyan û homeostazê girîng e. Ji bilî rêzkirina bi navbeynkariya qalikê, rola lîpîdan di rêzkirina kînesin de di pêvajoya veguhastina veşartinê de pirsek bingehîn a demdirêj e ku hîn nehatiye bersivandin. Li vir, em wênekêşiya demrast a pirreng a 3D ya hevdem a çareseriya bilind pêk tînin da ku di vivo de îspat bikin ku proteînên nû sentezkirî yên glîkozîlfosfatîdîlînosîtol-ê bêmobîlkirî yên bi beşên lîpîd ên seramîd ên pir dirêj têne kom kirin û di nav endoplazmayên taybetî de têne dabeş kirin Cihê derketina net, ku ji ya ku ji hêla proteînên transmembran ve tê bikar anîn cûda ye. Wekî din, em nîşan didin ku dirêjahiya zincîra seramîdê di membrana retîkuluma endoplazmîk de ji bo vê hilbijartina rêzkirina krîtîk e. Lêkolîna me yekem delîla rasterast a di vivo de peyda dike da ku barên proteînê li gorî dirêjahiya zincîra lîpîdê di nav cihên hinardekirina bijartî di rêça veşartinê de dabeş bike.
Di hucreyên eukaryotîk de, proteînên ku di retîkuluma endoplazmîk (ER) de têne sentezkirin, dûv re di dema veguhastinê de bi rêya veşartinê ji bo radestkirina cihê wan ê hucreyî yê guncaw têne rêzkirin (1). Ji bilî rêzkirina bi navbeynkariya kincê, demek dirêj dihat texmînkirin ku hin lîpîd dikarin wekî xalên derketinê yên bijartî jî xizmet bikin bi komkirina wan di nav deverên membranê yên taybetî de ku proteînên taybetî ne (2-5). Lêbelê, hîn jî nebûna delîlên rasterast ên in vivo heye ku vê mekanîzmaya gengaz a li ser bingeha lîpîdê îspat bike. Ji bo çareserkirina vê pirsgirêka bingehîn, me di hevîrtirşkê de lêkolîn kir ka proteînên bi glîkozîlfosfatîdîlînosîtol (GPI) ve girêdayî (GPI-AP) çawa bi awayekî cûda ji ER têne hinardekirin. GPI-AP cûrbecûr proteînên rûyê hucreyê yên bi lîpîdê ve girêdayî ne (6, 7). GPI-AP proteînek veşartî ye ku bi rêya beşa glîkolîpîd (lengera GPI) bi pelên derveyî yên membrana plazmayê ve girêdayî ye. Ew lengerên GPI wekî guhertinên piştî-wergerandinê yên parastî di lûmena ER de qebûl dikin (8). Piştî girêdanê, GPI-AP ji ERê derbasî parzûna plazmayê dibe di nav amûra Golgi (5, 9). Hebûna lengerên GPIyê dibe sedema ku GPI-AP ji proteînên veşartî yên transmembranê (di nav de proteînên din ên parzûna plazmayê) bi rêya veşartinê cuda were veguhastin (5, 9, 10). Di şaneyên hevîrtirşkê de, GPI-AP di retîkula endoplazmîk de ji proteînên din ên veşartî têne veqetandin, û dûv re di vezîkulên bêhempa de têne pak kirin ku bi kompleksa proteîna pêçanê II (COPII) ve têne pêçandin (6, 7). Faktorên diyarker ên vê pêvajoya dabeşkirinê di pêvajoya hinardekirina ERê de ne diyar in, lê tê texmîn kirin ku ev mekanîzma dibe ku lîpîdan hewce bike, nemaze ji nû ve avakirina avahîsaziyê ya beşa lîpîd a lengerê GPIyê (5, 8). Di hevîrtirşkê de, ji nû ve avakirina lîpîdên GPIyê tavilê piştî girêdana GPIyê dest pê dike, û di gelek rewşan de, dibe sedema girêdana seramîdê bi asîda rûnê têrbûyî ya zincîra dirêj a 26-karbonî (C26:0) (11, 12). Seramîda C26 seramîda sereke ye ku heta niha ji hêla şaneyên hevîrtirşkê ve tê hilberandin. Ew di ER de tê sentezkirin û piraniya wê bi rêya vezîkulên COPII bo amûra Golgi tê şandin (13). Hinardekirina GPI-AP bo ER bi taybetî senteza seramîdê ya berdewam hewce dike (14, 15), û di encamê de, veguherîna seramîdê bo seramîda fosfata înozîtol (IPC) di amûra Golgi de bi senteza lengerê GPI ve girêdayî ye (16). Lêkolînên biyofîzîkî yên bi membranên çêkirî nîşan dane ku seramîdên zincîra asîl a pir dirêj dikarin bi hev re bibin yek da ku domainên rêkûpêk bi taybetmendiyên fîzîkî yên bêhempa çêbikin (17, 18). Ev dane rê li ber hîpotezê vedikin ku seramîda C26 û GPI-AP bi seramîda C26 re taybetmendiyên xwe yên fîzîkî bikar tînin da ku di nav herêmên rêkûpêk an jî herêmên di hawîrdora lîpîd a membrana ER ya nisbeten tevlihev de bibin yek. Ew bi giranî ji glîserolîpîdên kurt û netêrkirî pêk tê (C16:1 û C18:1) (19, 20). Ev herêm dê bi awayekî bijartî li ser cihên derketina ER-ê yên taybetî (ERES) werin balkişandin, ku seramîd û GPI-AP-ya li ser bingeha seramîdê dikarin bi hev re di heman vezîkula COPII-ya taybetî de ber bi Golgi ve werin veguhastin (5).
Di vê lêkolînê de, me ev mekanîzmaya li ser bingeha lîpîdan rasterast bi karanîna mîkroskopiya wênekirina demrast a konfokal a pir-çareseriyê (SCLIM) ceriband, ku teknîkek mîkroskopiyê ya pêşkeftî ye ku dikare di heman demê de proteînên bi floresan nîşankirî bibîne. Wêneyên sê-reng û sê-alî (3D) di şaneyên zindî de xwedî çareserî û leza pir bilind in (21, 22).
Me pêşî teknolojiya SCLIM bikar anî da ku em bêtir diyar bikin ka GPI-AP-ya normal bi koma seramîdê ya C26-ê çawa ji proteînên veşartî yên transmembranî piştî derketina ji ER-ê di S. cerevisiae de hate kontrol kirin. Ji bo kontrolkirina dabeşkirina ER-ê, me pergalek genetîkî bikar anî ku dikare rasterast barhilgira nû sentezkirî ya ku di nav ERES-ê de di vivo de dikeve dîtbarî bike (7, 23). Wekî barhilgir, me GPI-AP Gas1-a bingeha seramîdê ya C26-ê ku bi proteîna fluoresansa kesk (GFP) hatiye nîşankirin û proteîna veşartî ya transmembranî Mid2 ku bi proteîna fluoresansa nêzîk-infrared (iRFP) hatiye nîşankirin hilbijart, ku her du jî parzûna plazmayê hedef digirin (24-26). Di mutanta hesas a germahiyê ya sec31-1 de, ev her du barhilgir di bin pêşvebirek galaktoz-çalakker û nîşankerek ERES-a damezrîner de têne îfade kirin. Di germahiya zêde de (37°C), ji ber ku mutasyona sec31-1 bandorê li fonksiyona pêkhateya pêça COPII Sec31 dike da ku şînbûna COPII û derxandina ER-ê asteng bike, barhilgira nû sentezkirî li ER-ê kom dibe (23). Piştî sarkirinê heta germahiyek nizm (24°C), şaneyên mutant ên sec31-1 ji herêma veşartinê vegeriyan, û barkêşiya sentetîk a nû ya kombûyî dest bi hinartinê ji ER kir. Dîtbarîkirina CLIM nîşan da ku piraniya Gas1-GFP û Mid2-iRFP-ya nû sentezkirî piştî înkubasyonê li 37°C û dûv re di 24°C de ji bo 5 hûrdeman berdan, hîn jî di ER-ya şaneyên mutant ên sec31-1 de kom bûne (Wêne 1). Ji ber ku Mid2-iRFP li ser tevahiya parzûna ER-ê belav bûye, û Gas1-GFP di herêma parzûna ER-ê ya bênavber de kom bûye û kom bûye, belavbûna wan bi tevahî cûda ye (Wêne 1, A heta C û Fîlm S1). Wekî din, wekî ku di Wêne 1D de tê xuyang kirin, koma Gas1-GFP Mid2-iRFP tune. Ev encam nîşan didin ku proteînên GPI-AP û transmembranê di destpêkê de di herêmên cuda yên parzûna ER-ê de hatine veqetandin. Koma Gas1-GFP li kêleka ERES-ek taybetî ye ku bi proteîna pêçanê ya COPII ya mCherry Sec13 hatiye nîşankirin (Wêne 1, E û F, û fîlma S1) (23).
Xaneyên sec31-1 veşartinên ji ber galaktozê çêdibin, seramîda zincîra asîl a dirêj (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, kesk) û proteîna transmembranê Mid2-iRFP (TMP, şîn) îfade dikin û ev nîşankirina ERES a Avaker Sec13-mCherry (ERES, magenta) di 37°C de ji bo 30 hûrdeman hate înkubasyon kirin, bo 24°C hate veguheztin, û 5 hûrdeman şûnda bi SCLIM hate wêne kirin. (A heta C) wêneyek nûner a yekbûyî an yekane ya 2D ya rûberek nîşan dide (A), wêneyek projeksiyona 2D ya 10 beşên z (B) an wêneyek nîvkada hucreyê ya 3D ya bar û nîşankerên ERES (C). Pîvana çîpê 1μm (A û B). Yekîneya pîvanê 0.551μm e (C). Gas1-GFP di herêmên an komên ER yên cihêreng de hate tespît kirin, di heman demê de Mid2-iRFP li seranserê membrana ER hate tespît kirin û belav kirin (C). (D) Grafîk şiddeta fluoresansa nisbî ya Gas1-GFP û Mid2-iRFP di koma Gas1-GFP de li ser xeta tîra spî (çep) nîşan dide. AU, yekîneya kêfî. (E û F) wêneya 3D temsîl dikin ku nîşana kelûpelan û ERES-ê li hev dicivîne. Komên Gas1-GFP li nêzî ERES-a taybetî hatin tespît kirin. Yekîneya pîvanê 0.551μm e. (F) Tîra spî ya zexm koma Gas1-GFP-ê ya bi ERES-ê ve girêdayî nîşan dide. Panelên navîn û rast wêneya 3D-ya mezinbûyî ya yekbûyî û dîtinek zivirî ya koma Gas1-GFP-ya bijartî nîşan didin.
Têkiliya fezayî ya nêzîk di navbera koma Gas1-GFP û ERES-ek taybetî de nîşan dide ku Gas1-GFP dikare bikeve ERES-a bijartî, ku ji bijartîbûna ku ji hêla Mid2-iRFP ve ji bo derketina ji ER-ê tê bikar anîn cuda ye. Ji bo çareserkirina vê îhtîmalê, me rêjeya ERES-ê tenê ji bo yek an du tiştan hejmar kir (Wêne 2, A heta C). Me dît ku piraniya ERES-an (70%) tenê yek celeb bar dihewîne. Wêneya jêrîn a Wêne 2C du mînakên tîpîk ên ERES-ê bi tenê Gas1-GFP (Wêne 1) an tenê Mid2-iRFP (Wêne 2) nîşan dide. Berevajî vê, bi qasî 20% ji ERES-ê du bar dihewîne ku di heman deverê de li hev dikevin. Hat dîtin ku hin ERES (10%) du celeb bar dihewînin, lê ew di deverên bi eşkere cuda de hatine veqetandin. Ji ber vê yekê, ev analîza statîstîkî nîşan dide ku piştî ku ER tê hinardekirin, GPI-AP Gas1-GFP û barkirina transmembranî Mid2-iRFP di ERES-ên cûda de têne dabeş kirin (Wêne 2D). Ev karîgeriya rêzkirinê pir lihevhatî ye bi analîza biyokîmyayî ya berê (6) û diyarkirina morfolojîk (7). Em dikarin tevgera barkêşa karantînkirî ya ku dikeve ERESê jî bibînin (Wêne 2E û Fîlm S2). Wêne 2E nîşan dide ku tenê beşek piçûk ji Gas1-GFP (panel 3) an Mid2-iRFP (panel 4) ji aliyekî ve dikeve ERESê û di deverek cuda de tê sînordarkirin. Panel 5 a Wêne 2E nîşan dide ku Gas1-GFP û Mid2-iRFP carinan di heman ERESê de têne dîtin, lê ew ji aliyên cûda dikevin û di herêmên cuda de kom dibin ku dibe ku vezîkulên COPII yên cûda temsîl bikin. Me her weha piştrast kir ku veqetandin û dabeşkirina çavdêrîkirî ya GPI-AP Gas1 a li ser bingeha seramîdê C26 wekî ERES-a bijartî taybetî ye ji ber ku barkêşek din a veşartina transmembranê, proteîna membrana plazmayê ya bi nîşana GFP Axl2 (27), tevgerînek dişibihe Mid2-iRFP nîşan dide. (Wêne S1 û Fîlm S3). Axl2-GFP-ya nû sentezkirî mîna Mid2-iRFP (Wêne S1, A û B) di nav parzûna ER-ê de belav dibe, û di piraniya ERES-an de bi Mid2-iRFP-ê re hev-cih dibe (Wêne S1, B heta D). Panelên 1 û 2 yên Wêne 1. S1C du mînakên tîpîk ên ERES nîşan dide ku du barên transmembranî li hev dikevin. Di van rewşan de, her du kelûpel bi hev re dikevin ERES-ê (Wêne S1E, Panel 3 û Fîlm S3).
Hucreyên sec31-1 ên ku veşartinên ku bi galaktozê têne çalakkirin, Gas1-GFP (GPI-AP, kesk) û Mid2-iRFP (TMP, şîn) û nîşankirina ERES ya damezrîner Sec13-mCherry (ERES, magenta) derdixin, di 37°C de hatin danîn. Piştî 30 deqîqeyan di °C de înkubasyonê, ji bo berdana bloka veşartinê biçin 24°C, û piştî 20 deqîqeyan bi SCLIM wêne bikin. (A heta C) Wêneyên projeksiyona 2D ya nûner (A; barê pîvanê, 1μm) an wêneyên nîvkada hucreyê yên 3D (B û C; yekîneya pîvanê, 0.456μm) yên bar û 10 beşên z-yê yên ku ji hêla ERES ve hatine nîşankirin. Panela jêrîn a di (B) de û panela di (C) de wêneyên pêvajoyî nîşan didin da ku tenê tiştên ku di ERES (magenta) de hene nîşan bidin [Gas1-GFP (gewr) û Mid2-iRFP (şînê vekirî)]. (C) Tîra vekirî: ERES tenê perçeyek bar hildigire (1 heta 4). Tîra gewr: ERES barhilgirên veqetandî (5) dihewîne. Tîra spî ya zexm: ERES barhilgirên hev-cih dihewîne. Li jêr: ERES-a yekane ya bijartî tenê Gas1-GFP (1) an Mid2-iRFP (2) dihewîne. Şêweya pîvanê, 100 nm. (D) Pîvandina fotomîkrografê ya ku di (C) de hatî vegotin. Rêjeya navînî ya ERES-ê ku tenê barhilgirek (Gas1-GFP an Mid2-iRFP), barhilgirên veqetandî û barhilgirên hevgirtî dihewîne. Di sê ceribandinên serbixwe de, n=432 di 54 xaneyan de. Şêweya çewtiyê = SD. Testa t ya du-alî ya nehevber. *** P = 0.0002. (E) Wêneya 3D ya ERES-a bijartî ya barhilgirên karantînkirî yên bi (C) hatine nîşankirin. Gas1-GFP (kesk) (3) an Mid2-iRFP (şîn) (4) ji aliyekî ve dikeve ERES (magenta) û bi qadeke piçûk di nav ERES-ê de sînordar e. Carinan, her du celeb bar ji heman alî ve dikevin heman ERES (5) û di nav ERES de bi deverek îzolekirî ve sînordar dibin. Pîvana pîvanê, 100 nm.
Piştre, me hîpotezek ceriband ku seramîda zincîra asîl a dirêj (C26) a ku di nav parzûna ER de heye, kombûn û rêzkirina taybetî ya Gas1 di ERES-a bijartî de dimeşîne. Ji bo vê armancê, me cureyek hevîrtirşkê ya guhertî GhLag1 bikar anî, ku tê de du sîntazên seramîdê yên endojîn Lag1 û Lac1 bi GhLag1 (homologa Lag1 a pembû) hatin guheztin, di encamê de cureyek hevîrtirşkê bi cureyek Seramîd a parzûna şaneyê ya ji cureya kovî kurttir çêbû (Wêne 3A) (28). Analîza spektrometriya girseyî (MS) nîşan da ku di cureyên cureya kovî de, %95ê tevahiya seramîdê seramîda zincîra pir dirêj (C26) ye, lê di GhLag1 de, %85ê seramîdê pir dirêj e (C18 û C16). ), tenê %2ê seramîdê seramîda zincîra pir dirêj (C26) ye. Her çend seramîdên C18 û C16 seramîdên sereke ne ku heta niha di nav parzûna GhLag1 de hatine tespîtkirin, analîza MS jî piştrast kir ku lengera GPI ya Gas1-GFP ya ku di şaneya GhLag1 de tê îfadekirin seramîda C26 dihewîne, ku bi lîpîdên celebê kovî re tê berhev kirin. Kalîte yek e (Wêne 3A) (26). Ji ber vê yekê, ev tê vê wateyê ku enzîma nûavakirina seramîdê Cwh43 ji bo seramîda C26 pir bijartî ye, wekî ku di Wêne 26 de tê xuyang kirin, ew bi tercîhî lengera GPI ji mîqdarek piçûk a seramîda C26 di şaneya GhLag1 de vedihewîne. S2 (29). Digel vê yekê, parzûna hucreyê ya GhLag1 bi bingehîn tenê seramîda C18-C16 dihewîne, lê Gas1-GFP hîn jî seramîda C26 heye. Ev rastî vê şaneyê dike amûrek îdeal ji bo çareserkirina bi taybetî ya pirsgirêka dirêjahiya zincîra asîl a seramîda parzûnê di ER de. Rola hîpotetîk a çîn û rêzkirinê. Paşê, me pêşî şiyana C26 Gas1-GFP ya kombûna di koman de di GhLag1 de bi alelek mutant a hesas a germahiyê ya sec31-1 bi rêya mîkroskopiya fluoresansa kevneşopî lêkolîn kir, ku tenê zincîra dirêj (C18-C16) di nav parzûna ER Seramîd de heye (Wêne 3). Me dît ku di sec31-1 de, piraniya Gas1-GFP di koman de kom bû, lê Gas1-GFP di sec31-1 GhLag1 de bi parzûna ER ya seramîd a dirêj (C18-C16) bi piranî ne kom bû û di tevahiya parzûna ER de belav nebû. Bi rastî, ji ber ku kombûna li ser bingeha seramîdê ya C26 bi ERES-a taybetî ve girêdayî ye (Wêne 1), me paşê lêkolîn kir ka gelo ev pêvajo dibe ku fonksiyona mekanîzmaya proteîna hinardekirina ER jî di nav xwe de bigire. GPI-AP ji bo hinardekirina ER pergalek COPII ya taybetî bikar tîne, ku bi awayekî çalak ji hêla ji nû ve avakirina avahiya Ted1 ya beşa glîkanê ya lengerê GPI ve tê rêve kirin (30, 31). GPI-glîkana rekombinant dû re ji hêla kompleksa wergirê barkêşiya transmembranî p24 ve tê nas kirin, ku di encamê de bi awayekî bijartî Lst1 digire, ku îzoformek taybetî ya yekîneya girêdana barkêşiya COPII ya sereke Sec24 e, û Vezîkulên COPII yên dewlemend bi GPI-AP çêdike (31-33). Ji ber vê yekê, me mutantek ducar çêkir ku jêbirina van proteînên yekane (pêkhateya kompleksa p24 Emp24, enzîma nûvekirina GPI-glîkan Ted1 û yekîneya COPII ya taybetî Lst1) bi şaneya mutant a sec31-1 re kir yek, û wan lêkolîn kir Ma gengaz e ku GFP-ya koma Gas1 çêbibe (Wêne 3). Me dît ku di sec31-1emp24Δ û sec31-1ted1Δ de, Gas1-GFP bi piranî nekomkirî ye û li seranserê membrana ER belav bûye, wekî ku berê di sec31-1 GhLag1 de hate dîtin, dema ku di sec31-1lst1Δ de, Gas1-GFP Mîna sec31-1. Ev encam nîşan didin ku ji bilî hebûna seramîda C26 di nav parzûna ER de, kombûna Gas1-GFP jî hewce dike ku bi kompleksa p24 ve were girêdan, û hewcedarî bi komkirina Lst1 ya taybetî nake. Piştre, me îhtîmala ku dirêjahiya zincîra seramîdê di parzûna ER de dikare girêdana Gas1-GFP bi p24 re rêkûpêk bike lêkolîn kir. Lêbelê, me dît ku hebûna seramîda C18-C16 di parzûnê de bandorê li ser GPI-glîkanên ku ji hêla kompleksa p24 ve hatine çêkirin (Wêneyên S3 û S4, A û B) an girêdana bi GPI-AP û hinardekirina GPI-AP nake. Jêrtîpa COPII Lst1 bigirin (Wêneya S4C). Ji ber vê yekê, kombûna girêdayî seramîdê C26 têkiliyên proteînê bi mekanîzmayên proteîna hinardekirina ER yên cûda re hewce nake, lê piştgirî dide mekanîzmayek rêzkirina alternatîf a ku ji hêla dirêjahiya lîpîdê ve tê rêve kirin. Piştre, me analîz kir ka dirêjahiya zincîra asîl a seramîdê di parzûna ER de ji bo dabeşkirina bi bandor a Gas1-GFP wekî ERES-a bijartî girîng e. Ji ber ku Gas1 di nav şaneya GhLag1 de bi seramîda zincîra kurt ji ER derdikeve û dikeve nav parzûna plazmayê (Wêneya S5), em bawer dikin ku heke rêzkirin ji hêla dirêjahiya zincîra asîl a seramîdê ve were rêvebirin, Gas1 di şaneya GhLag1 de dikare were beralîkirin û were derbaskirin. Kelûpelên ERES bi heman parzûnê.
(A) Parzûna şaneyê ya GhLag1 bi giranî seramîdên C18-C16 yên kurttir dihewîne, lê lengerê GPI yê Gas1-GFP hîn jî heman IPC-ya C26 wekî şaneyên celebê kovî heye. Li jor: analîza dirêjahiya zincîra asîl a seramîdê di parzûna şaneyê ya şaneyên celebê kovî (Wt) û GhLag1p de bi spektrometriya girseyî (MS). Daneyên rêjeya tevahî ya seramîdê temsîl dikin. Navîniya sê ceribandinên serbixwe. Çewtiya xêza = SD. Testa t-ya du-alî ya nehevber. **** P <0.0001. Panela jêrîn: Analîza MS-ê ya dirêjahiya zincîra asîl a IPC-ya ku di lengerê GPI yê Gas1-GFP (GPI-IPC) de heye ku di şaneyên celebê kovî û GhLag1p de tê îfade kirin. Daneyên rêjeya tevahî ya sînyala IPC temsîl dikin. Navîniya pênc ceribandinên serbixwe. Çewtiya xêza = SD. Testa t-ya du-alî ya nehevber. ns, ne girîng e. P = 0.9134. (B) Mîkrografên flûoresansê yên şaneyên sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ û sec31-1lst1Δ yên ku Gas1-GFP ya ji ber galaktozê derketiye holê, di 37°C de ji bo 30 deqîqeyan hatin înkubekirin û piştî 24°C ji bo mîkroskopiya flûoresansê ya rûtîn hatin veguhastin. Tîra spî: Koma ER Gas1-GFP. Tîra vekirî: Gas1-GFP ya nekomkirî li ser tevahiya parzûna ER belav bûye, ku boyaxkirina xeleka navokî ya taybetmendiya ER nîşan dide. Şêweya pîvanê, 5μm. (C) Hejmarkirina fotomîkrografê ku di (B) de hatî vegotin. Rêjeya navînî ya şaneyên bi avahiya Gas1-GFP ya xalxalî. Di sê ceribandinên serbixwe de, n≥300 şane. Şêweya çewtiyê = SD. Testa t ya du-alî ya nehevber. **** P <0.0001.
Ji bo çareserkirina rasterast a vê pirsgirêkê, me dîtbarîkirina SCLIM a Gas1-GFP û Mid2-iRFP di GhLag1 de bi alela mutant a hesas a germahiyê ya sec31-1 pêk anî (Wêne 4 û Fîlma S4). Piştî ku ER di 37°C de hate parastin û paşê di 24°C de hate berdan, piraniya Gas1-GFP-ya nû sentezkirî li seranserê parzûna ER-ê nehat komkirin û belav kirin, wekî ku ji hêla mîkroskopên kevneşopî ve hatî dîtin (Wêne 4, A û B). Wekî din, rêjeyek mezin a ERES (67%) du celeb barên ku di nav xwe de bi hev re cih digirin vedihewîne (Wêne 4D). Panelên 1 û 2 yên Wêneya 4C du mînakên tîpîk ên ERES-ê bi Gas1-GFP û Mid2-GFP-ya hevbeş nîşan didin. Wekî din, her du kelûpel jî di heman ERES-ê de hatin tevlîkirin (Wêne 4E, panela 3 û fîlma S4). Ji ber vê yekê, encamên me nîşan didin ku dirêjahiya zincîra asîl a seramîd di parzûna ER-ê de diyarkerek girîng a kombûn û dabeşkirina proteîna ER-ê ye.
Xaneyên Sec31-1 GhLag1 ên ku veşartinên ji ber galaktozê derdikevin, Gas1-GFP (GPI-AP, kesk) û Mid2-iRFP (TMP, şîn) û Sec13-mCherry ya bi ERES-ê nîşankirî ya damezrîner (ERES, magenta) di 37°C de înkubasyon bikin. 30 deqîqeyan berdewam bikin, daxin 24°C da ku veşartin serbest bên berdan, û piştî 20 deqîqeyan bi SCLIM wêne bikin. (A heta C) Wêneyên projeksiyona 2D ya temsîlkar (A; şîpa pîvanê, 1μm) an wêneyên nîvkada hucreyê ya 3D (B û C; yekîneya pîvanê, 0.45μm) ji 10 beşên z-yê yên ku bi bar û ERES-ê hatine nîşankirin. Panela jêrîn a di (B) de û panela di (C) de wêneyên pêvajoyî nîşan didin da ku tenê tiştên ku di ERES (magenta) de hene nîşan bidin [Gas1-GFP (gewr) û Mid2-iRFP (şînê vekirî)]. (C) Tîra tijî spî: ERES, tiştên li hev dikevin. Tîra vekirî: ERES tenê yek babetî dihewîne. Panela jêrîn: ERES-a bijartî kelûpelên hevgirtî (1 û 2) di (C) de nîşankirî hene. Şêweya pîvanê, 100 nm. (D) Pîvandina fotomîkrografê ya ku di (C) de hatiye vegotin. Di yekîneyên sec31-1 û sec31-1 GhLag1 de, tenê yek bar (Gas1-GFP an Mid2-iRFP) tê de ye, û rêjeya navînî ya ERES ji bo barên îzolekirî û barên hevgirtî. Di sê ceribandinên serbixwe de, n = 432 di 54 xaneyan de (sec31-1) û n = 430 di 47 xaneyan de (sec31-1 GhLag1). Şêweya çewtiyê = SD. Testa t ya du-alî ya nehevgirtî. *** P = 0.0002 (sec31-1) û ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Wêneya 3D ya ERES-a bijartî bi barên hevgirtî (3) ku di (C) de nîşankirî ye. Gas1-GFP (kesk) û Mid2-iRFP (şîn) ji heman alî ve nêzîkî ERES (mor) dibin û di heman devera sînorkirî ya ERES de dimînin. Şêweya pîvanê, 100 nm.
Ev lêkolîn delîlên rasterast ên in vivo peyda dike ku barhilgirên proteîna li ser bingeha lîpîdan di rêça veşartinê de di nav deverên hinardekirinê yên bijartî de têne dabeş kirin, û girîngiya dirêjahiya zincîra asîl ji bo hilbijartina dabeşkirinê eşkere dike. Bi karanîna teknîkek mîkroskopiyê ya bihêz û pêşkeftî ya bi navê SCLIM, me Gas1-GFP-ya nû sentezkirî (GPI-AP-ya sereke ya membrana plazmayê bi beşek lîpîdê ya seramîdê ya zincîra asîl (C26) a pir dirêj) di hevîrtirşkê de nîşan da. Herêmên ku di ER-yên cihêreng de kom bûne bi ERES-ên taybetî ve girêdayî ne, di heman demê de proteînên veşartî yên transmembranî li seranserê membrana ER-ê têne belav kirin (Wêne 1). Wekî din, ev her du celeb kelûpel bi bijartî dikevin ERES-ên cûda (Wêne 2). Dirêjahiya zincîra asîl a seramîda hucreyî di membranê de ji C26 kêm dibe C18-C16, koma Gas1-GFP di nav herêma ER-ya cihêreng de tê hilweşandin, û Gas1-GFP ji nû ve tê rêve kirin da ku ER-ê bi proteîna transmembranî re bi rêya heman ERES-ê bihêle (Wêne 3 û Wêne 3). 4).
Her çend GPI-AP mekanîzmayeke proteîna taybet bikar tîne da ku ji ER derkeve jî, me dît ku veqetandina girêdayî seramîdê ya C26 xwe nespêre têkiliyên proteîna cuda ku dibe ku bibe sedema pisporbûna ERES (Wêneyên S4 û S5). Di şûna wê de, dîtinên me piştgirî didin mekanîzmayeke dabeşkirinê ya alternatîf ku ji hêla kombûna proteîna li ser bingeha lîpîdê û dûrxistina barên din ve tê rêvebirin. Çavdêriyên me nîşan didin ku herêm an koma Gas1-GFP ya ku bi ERES-ek taybetî ve girêdayî ye, proteîna Mid2-iRFP ya veşartî ya transmembranî tune ye, ku nîşan dide ku koma GPI-AP ya girêdayî seramîdê ya C26 dê ketina wan a nav ERES-a têkildar hêsan bike, û di heman demê de, veşartinên transmembranî derxîne. Veşartin dikevin vê ERES-a taybetî (Wêneyên 1 û 2). Berevajî vê, hebûna seramîdên C18-C16 di nav membrana ER de nahêle ku GPI-AP herêm an koman çêbike, ji ber vê yekê ew proteînên veşartî yên transmembranî di heman ERES-ê de dernaxin an jî nagirin şûna wan (Wêneyên 3 û 4). Ji ber vê yekê, em pêşniyar dikin ku seramîda C26 bi hêsankirina kombûna proteînên ku bi ERES-a taybetî ve girêdayî ne, veqetandin û dabeşkirinê dimeşîne.
Meriv çawa dikare vê kombûna girêdayî seramîdê ya C26 di nav deverek ER-ya taybetî de bi dest bixe? Meyla seramîda parzûnê ya ji bo veqetandina alî dibe ku bibe sedema ku GPI-AP û seramîda C26 di hawîrdora lîpîdên bêserûber ên parzûna ER-ê de ku glîserolîpîdên kurttir û netêrbûyî dihewîne, lîpîdên piçûk û yekser rêzkirî çêbikin. Komên bi kalîte (17, 18). Ev komên demkî yên piçûk dikarin piştî girêdana bi kompleksa p24 re bêtir bibin komên mezintir û aramtir (34). Li gorî vê yekê, me nîşan da ku C26 Gas1-GFP hewce dike ku bi kompleksa p24 re têkilî dayne da ku komên xuya yên mezintir çêbike (Wêne 3). Kompleksa p24 olîgomerek heterozîgot e ku ji çar proteînên transmembranê yên p24 yên cûda di hevîrtirşkê de pêk tê (35), ku girêdana piralî peyda dike, ku dikare bibe sedema girêdana xaçerê ya komên piçûk ên GPI-AP, bi vî rengî koma Stabîl a mezintir çêdike (34). Têkiliya di navbera ektodomên proteînê yên GPI-AP-an de jî dibe ku beşdarî kombûna wan bibe, wekî ku di dema veguhastina wan a Golgi de di hucreyên epitelyal ên polarîzekirî yên memikan de tê xuyang kirin (36). Lêbelê, dema ku seramîda C18-C16 di nav parzûna ER de hebe, dema ku kompleksa p24 bi Gas1-GFP ve girêdide, komên mezin ên cuda çênabin. Mekanîzma bingehîn dikare bi taybetmendiyên fîzîkî û kîmyewî yên taybetî yên seramîda zincîra asîl a dirêj ve girêdayî be. Lêkolînên biyofîzîkî yên parzûnên çêkirî nîşan didin ku her çend hem seramîdên zincîra asîl a dirêj (C24) û hem jî kurt (C18-C16) dikarin bibin sedema veqetandina qonaxê, tenê seramîdên zincîra asîl a dirêj (C24) dikarin Qurvature-ya bilind û xwarbûna fîlimê pêşve bibin da ku fîlimê ji nû ve şekil bikin. Bi rêya referansa hevbeş (17, 37, 38). Hatiye nîşandan ku helîxa transmembranê ya TMED2, homologê mirovî yê Emp24, bi awayekî bijartî bi sphîngomielîna bingeha seramîdê ya C18 di lobulên sîtoplazmayî de têkilî datîne (39). Bi karanîna simulasyonên dînamîkên molekulî (MD), me dît ku hem seramîdên C18 û hem jî C26 li dora lobulên sîtoplazmayî yên helîksa transmembranî ya Emp24 kom dibin, û tercîhên wan ên wekhev hene (Wêneya S6). Hêjayî gotinê ye ku ev nîşan dide ku helîksa transmembranî ya Emp24 dikare bibe sedema belavkirina asîmetrîk a lîpîdan di nav parzûnê de. Ev encamek dawî ye ku li ser hucreyên memikan hatiye damezrandin. Simulasyonên MD yên wekhev hebûna lîpîdên eter jî nîşan didin (40). Ji ber vê yekê, em texmîn dikin ku seramîda C26 di her du lobulên ER26 de bi awayekî herêmî dewlemend dibe. Dema ku GPI-AP di lobulên luminal de rasterast bi p24-a pirvalent ve girêdide û kombûna seramîda C26 li dora p24 di lobulên sîtoplazmayî de, ew dikare kombûna Proteîna pêvek pêşve bibe û xêzbûna parzûnê bi rêya tiliyan çêdibe (41), dibe sedema ku GPI-AP di nav herêmên cihêreng ên li kêleka ERES-ê de veqete, ku ev jî herêmên pir xêzkirî yên parzûna ER-ê tercîh dike (42). Raportên berê piştgirî dan mekanîzmaya pêşniyarkirî (43, 44). Girêdana piralî ya olîgolektîn, patojen an antîkoran bi glîkosfîngolîpîdên seramîdê (GSL) re li ser parzûna plazmayê dibe sedema kombûna mezin a GSL, veqetandina qonaxê zêde dike û dibe sedema deformasyon û navxweyîbûna parzûnê (44). Iwabuchi hwd. (43) Hat dîtin ku di hebûna zincîrên asîl ên dirêj (C24) lê ne kurt (C16), lîganda piralî ya bi laktozilseramîda GSL ve girêdayî çêbûna komên mezin û daketina parzûnê çêdike, û veguherîna sînyala sîtoplazmayê ya bi navbeynkariya Lyn li ser pelikan ji hêla zincîrên asîl ve di nav neutrofîlên girêdayî de tê tevlihev kirin.
Di hucreyên epitelyal ên polarîzekirî yên memikan de, rêjeya tora dij-Golgi (TGN) heta asta membrana plazmaya apîkal veqetandin û rêzkirina GPI-AP kontrol dike (10, 45). Ev kombûn ji hêla olîgomerîzasyona GPI-AP ve tê rêvebirin (36), lê dibe ku ew bi dirêjahiya zincîra seramîdê ve jî girêdayî be ku em di hevîrtirşkê de dibînin. Her çend GPI-AP ya memikan xwedî lengergehek li ser bingeha lîpîdên eter be, û avahiya wê ya kîmyewî ji seramîda zincîra asîl a pir dirêj pir cûda be jî, lêkolînek vê dawiyê dît ku her du lîpîd xwedî taybetmendî û fonksiyona fîzîkî û kîmyewî ya bi awayekî evolusyonî dişibin hev (40). Ji ber vê yekê, beşa lîpîda eter di hucreyên memikan de dibe ku dişibihe seramîda C26 di hevîrtirşkê de, û rola wê ew e ku bi seramîda zincîra dirêj di membranê de ve girêbide da ku kombûn û rêzkirina GPI-AP pêşve bibe. Her çend ev îhtîmal hîn jî hewce ye ku rasterast were ceribandin, dîtinên berê piştgirî dikin ku veguhastina seramîda zincîra asîl a dirêj berbi laşê Golgi ve ji hêla proteînên veguhastina sîtoplazmayî ve nayê kirin, lê bi senteza lengerên GPI yên mîna hevîrtirşkê ve girêdayî ye. Ji ber vê yekê, xuya ye ku mekanîzmaya parastî ya evolusyonî dikare bi awayekî bijartî seramîda zincîra asîl a pir dirêj û GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) di heman vezîkulê veguhastinê de bi hev re veguhezîne.
Di sîstemên şaneyên epitelyal ên polarîzekirî yên hevîrtirşk û memikan de, kombûn û veqetandina GPI-AP ji proteînên din ên membrana plazmayê hemî berî gihîştina rûyê şaneyê çêdibin. Paladino û hevkarên wî (48) dîtin ku li ser TGN-ya şaneyên epitelyal ên polarîzekirî yên memikan, kombûna GPI-AP ne tenê ji bo dabeşkirina bijartî ya GPI-AP-an bo membrana plazmaya apîkal pêwîst e, lê di heman demê de rêxistina kombûnê ya GPI-AP-an û çalakiya wê ya biyolojîk jî rêk dixe. Rûyê şaneyê. Di hevîrtirşkê de, vê lêkolînê nîşan da ku koma GPI-AP ya girêdayî seramîdê C26 li ser ER dikare rêxistina kombûnê û çalakiya fonksiyonel a GPI-AP li ser membrana plazmayê rêk bixe (24, 49). Li gorî vê modelê, şaneyên GhLag1 ji astengkerên GPI an dermanên ku bandorê li yekparçeyiya dîwarê şaneyê dikin alerjîk in (28), û hewcedariya komên Gas1-GFP yên fonksiyonel (49) ên seramîda serî ya ku di hevjînkirina şaneyên hevîrtirşkê de tê pêşandan nîşan dide. Encamên fîzyolojîk ên gengaz ên şaneyên hLag1. Çewtiya GPI-AP. Lêbelê, ceribandina bêtir ka rêxistina fonksiyonel a rûyê şaneyê ji ER-ê bi rêbazek rêzkirinê ya li ser bingeha dirêjahiya lîpîdan hatiye bernamekirin an na, dê mijara lêkolîna me ya pêşerojê be.
Şêweyên Saccharomyces cerevisiae yên ku di vê xebatê de hatine bikar anîn di Tabloya S1 de hatine rêzkirin. Şêweyên MMY1583 û MMY1635 yên SCLIM ji bo wênekirina şaneyên zindî di paşxaneya W303 de hatine çêkirin. Ev şeyên ku Sec13-mCherry bi etîketa proteîna fluoresan îfade dikin, bi karanîna rêbazek li ser bingeha reaksiyona zincîra polîmerazê (PCR) bi plazmîda pFA6a wekî şablon hatine çêkirin (23). Şêweya ku Mid2-iRFP îfade dike û bi proteîna fluoresan ve di bin kontrola pêşvebirê GAL1 de hatiye nîşankirin, wiha hatiye çêkirin. Amplifikasyona PCR ya rêza iRFP-KanMx ji vektora pKTiRFP-KAN (diyariya E. O'Shea, plazmîda Addgene jimara 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; nasnameya çavkaniya lêkolînê (RRID): Addgene_64687) Û di nav C-termînusa Mid2 ya endojîn de hatiye danîn. Piştî ku rêza genoma Mid2-iRFP hate zêdekirin û di nav promotera GAL1 de hate klonkirin, ew di nav cihê Not I-Sac I ya plazmîda entegrasyonê pRS306 de hate entegrekirin. Plazmîda pRGS7 ya encam bi Pst I re hate xêzikkirin da ku di nav lokusa URA3 de were entegrekirin.
Gena fuzyonê ya Gas1-GFP di bin kontrola pêşvebirê GAL1 de di plazmîda sentromer (CEN) de tê îfadekirin, ku wiha hatiye çêkirin. Rêzeya Gas1-GFP bi PCR ji plazmîda pRS416-GAS1-GFP (24) (diyariya L. Popolo) hate zêdekirin û di cîhê Xma I-Xho I ya plazmîda CEN pBEVY-GL LEU2 (diyariya C) de hate klonkirin. Miller; Hejmara plazmîda Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plazmîda encam wekî pRGS6 hate binavkirin. Gena fuzyonê ya Axl2-GFP jî di bin kontrola pêşvebirê GAL1 a vektora pBEVY-GL LEU2 de tê îfadekirin, û avakirina wê wiha ye. Rêza Axl2-GFP ji plazmîda pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) bi PCR hate zêdekirin, û di cihê Bam HI-Pst I yê vektora pBEVY-GL LEU2 de hate klonkirin. Navê plazmîda encamdayî pRGS12 bû. Rêza olîgonukleotîdên ku di vê lêkolînê de hatine bikar anîn di Tabloya S2 de hatîye rêzkirin.
Ji bo temamkirina asîdên amînî û bingehên pêwîst ji bo xurekiyê, cure bi %0.2 adenîn û %2 glukoz [YP-dekstroz (YPD)], %2 rafînoz [YP-rafînoz] navgîna proteîna p (YP) ya dewlemend bi ekstrakta hevîrtirşkê ya dewlemend bi navgîniya proteîna p (YP) (1% ekstrakta hevîrtirşkê û %2 proteîn ept). (YPR)] an %2 galaktoz [YP-galaktoz (YPG)] wekî çavkaniyek karbonê, an jî di navgînek sentetîk a mînîmal (0.15% bingeha nîtrojenê ya hevîrtirşkê û %0.5 sulfata amonyûmê) de hate zêdekirin, û wekî çavkaniyek karbonê asîdên amînî yên guncaw û bingehên pêwîst ji bo xwarinê tê de hene, û tê de %2 glukoz (navgîna mînîmal a glukoza sentetîk) an %2 galaktoz (navgîna mînîmal a galaktoza sentetîk) heye.
Ji bo wênekirina demrast, şaneyên mutant ên sec31-1 ên hesas ên germahiyê ku avahiyê di bin pêşvebirê GAL1 de îfade dikin, di navgîna YPR de di 24°C de tevahiya şevê heta qonaxa navîn a log hatin mezin kirin. Piştî enduksîyonê di YPG de di 24°C de ji bo 1 saetê, şaneyan di SG de di 37°C de ji bo 30 hûrdeman hatin înkubasyon kirin, û dûv re ji bo berdana ji bloka veşartinê veguheztin 24°C. Concanavalin A ji bo sabîtkirina şaneyan li ser slaytek cam hate bikar anîn û bi SCLIM hate wêne kirin. SCLIM tevlîheviyek ji mîkroskopa fluoresansa berevajîkirî ya Olympus IX-71 û lenza rûnê ya hejmarî ya UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), skanera konfokal a dîska zivirî ya leza bilind û rêjeya sînyala-deng a bilind (Yokogawa Electric), spektrometreya xwerû, û sarkirina xwerû ye. Zêdekirina wêneyê ya pergalê (Hamamatsu Photonics) dikare pergalek lenza mezinkirinê bi mezinkirina dawîn a ×266.7 û kamerayek cîhaza girêdayî barkirinê ku elektronan zêde dike peyda bike (Hamamatsu Photonics) (21). Bidestxistina wêneyê ji hêla nermalava xwerû (Yokogawa Electric) ve tê kirin. Ji bo wêneyên 3D, me aktûatorek pîezoelektrîkî ya xwerû bikar anî da ku lenza objektîfê bi awayekî vertîkal bihejîne, û beşên optîkî yên 100 nm ji hev dûr di steyek de berhev kirin. Wêneya Z-stek vediguhere daneyên voxel ên 3D, û fonksiyona belavbûna xala teorîk a ku ji bo mîkroskopa konfokal a dîska zivirî tê bikar anîn ji bo pêvajoya dekonvolasyonê ji hêla nermalava Volocity (PerkinElmer) ve tê bikar anîn. Bi karanîna nermalava Volocity ji bo analîza cîgirtinê ya otomatîk, ERES, tevî bar, hate pîvandin. Analîza şopandina xêzan bi karanîna nermalava MetaMorph (Molecular Devices) hate kirin.
Ji bo diyarkirina girîngiya îstatîstîkî, nermalava GraphPad Prism bikar bînin. Ji bo testa t-ya Xwendekarê du-alî û testa analîza guherbariya yekalî ya asayî (ANOVA), cudahîyên di navbera koman de wekî bandorek girîng li ser P <0.05 (*) têne hesibandin.
Ji bo mîkroskopiya flûoresansa Gas1-GFP, şaneyên qonaxa log di şevekê de di YPD de hatin mezin kirin û bi santrifujkirinê hatin berhev kirin, du caran bi şorbeya tamponkirî ya fosfatê hatin şuştin, û herî kêm 15 deqîqeyan li ser qeşayê hatin înkubasyon kirin, û dûv re di bin mîkroskopê de wekî ku berê hatî vegotin Check (24) berdewam kir. Mîkroskopa Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ku bi lenzek objektîf, fîltera L5 (GFP), kamera Hamamatsu û nermalava Application Suite X (LAS X) ve hatî saz kirin ji bo bidestxistinê hate bikar anîn.
Nimûne bi tampona nimûneya SDS di 65°C de ji bo 10 deqîqeyan hatin denatûrîzekirin, û dûv re bi elektroforeza jela SDS-polyacrylamide (PAGE) hatin veqetandin. Ji bo analîza îmmunoblottingê, 10 μl nimûne ji bo her rêzê hat barkirin. Antîkorê seretayî: Antî-Gas1 ya polîklonal a kêvroşk bi rêjeya 1:3000, antî-Emp24 ya polîklonal a kêvroşk bi rêjeya 1:500, û antî-GFP ya polîklonal a kêvroşk (diyariyek ji H. Riezman) bi rêjeya 1:3000 bikar bînin. Antîkorê monoklonal a antî-Pgk1 ya mişk bi rêjeya 1:5000 (diyariyek ji J. de la Cruz) hat bikar anîn. Antîkorê duyemîn: Îmmunoglobulin G (IgG) ya bizinê ya bi horseradish peroxidase (HRP) ya bi rêjeya 1:3000 (Pierce) hat bikar anîn. IgG ya bizinê ya bi HRP-yê ve girêdayî ya bi rêjeya 1:3000 (Pierce) hat bikar anîn. Herêma bersiva îmûnî bi rêbaza kîmîlûmînesansê ya reaktîfa SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) hate çavdêrîkirin.
Wekî ku di (31) de hatiye vegotin, ceribandineke îmmunoprecipitasyona xwezayî li ser fraksiyona ER ya dewlemendkirî hate kirin. Bi kurtasî, şaneyên hevîrtirşkê bi tampona TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenîlmetîlsulfonîl florîd û tevliheviya astengkerê proteazê) li 600 nm (OD600) bi densitiya optîkî ya 100 du caran bişon. Ew bi mûyên cam hate şikandin, û dûv re bermahiyên şaneyê û mûyên cam bi santrifujkirinê hatin rakirin. Dûv re supernatant bi 17,000 g ji bo 15 hûrdeman li 4°C hate santrifujkirin. Pelet di TNE de ji nû ve hate santrifujkirin û saponîna dîjîtalîs heta konsantrasyona dawîn a 1% hate zêdekirin. Santrifuj bi zivirandinê li 4°C ji bo 1 saetê hate înkubasyonkirin, û dûv re pêkhateyên neçareser bi santrifujkirinê li 13,000 g li 4°C ji bo 60 hûrdeman hatin rakirin. Ji bo îmûnprecipitasyona Gas1-GFP, pêşî nimûne bi morîkên agarozê yên vala (ChromoTek) di 4°C de ji bo 1 saetê pêş-înkubasyon bikin, û dûv re bi GFP-Trap_A (ChromoTek) di 4°C de ji bo 3 saetan înkubasyon bikin. Morîkên îmûn-precipitasyonkirî pênc caran bi TNE-ya ku %0.2 digoxigenin tê de heye hatin şuştin, bi tampona nimûneya SDS hatin elutekirin, li ser SDS-PAGE hatin veqetandin, û bi îmûnoblottingê hatin analîzkirin.
Wekî ku di (31) de hatiye vegotin, diyarkirina girêdana xaçerêyî li ser fraksiyona ER ya dewlemendkirî hate kirin. Bi kurtasî, fraksiyona ER ya dewlemendkirî bi 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 deqe) hate înkubasyon kirin. Reaksiyona girêdana xaçerêyî bi zêdekirina glîsînê (konsantrasyona dawî ya 50 mM, 5 deqe, 20°C) hate vemirandin.
Wekî ku berê hatiye vegotin (50), analîza MS ya seramîdê di şaneyên cureya kovî û GhLag1 de hate kirin. Bi kurtasî, şane di YPD de di 30°C de heta qonaxa eksponansiyel (3 heta 4 yekîneyên OD600/ml) hatin mezin kirin, û 25×107 şane hatin berhev kirin. Metabolîzma wan bi asîda trîkloroasetîk tê vemirandin. Çareseriya derxistinê [etanol, av, eter, pîrîdîn û 4.2 N hîdroksîda amonyûmê (15:15:5:1:0.018 v/v)] û 1.2 nmol ji kalîteya standarda navxweyî ya seramîdê C17 (860517, lîpîda polar avanti) bikar bînin. Ji bo pêkanîna hîdrolîza alkalîn a nerm a ekstraktê, reaktîfa monometîlamîn [metanol, av, n-butanol û çareseriya metîlamînê (4:3:1:5 v/v)] bikar bînin, û dûv re ji bo bêxwêkirina xwê n-butanol a bi avê têrkirî bikar bînin. Di dawiyê de, ekstrakt di çareserkera moda erênî de ji nû ve hate daliqandin [kloroform/metanol/av (2:7:1) + 5 mM asetata amonyûm] û di spektrometreya girseyî de hate derzîkirin. Ji bo destnîşankirin û hejmartina molekulên sfîngolîpîdê, çavdêriya pir-reaksiyonê (MRM) hate kirin. Spektrometreya girseyî ya çar-polî ya sêyemîn a TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) bi çavkaniyek îyonê ya robotîk a nanoflow Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ji bo analîza lîpîdan ve hatî çêkirin. Enerjiya pevçûnê ji bo her kategoriya seramîdê hatîye çêtirkirin. Daneyên MS di moda erênî de hatin bidestxistin. Ji bo her dubarekirina biyolojîkî, sînyala lîpîdê navîniya sê pîvandinên serbixwe ye.
Wekî ku di (31) de hatiye vegotin, şaneyên (800×107) ku Gas1-GFP îfade dikin, rastî îmûnpresîpîtasyona xwezayî hatin. Gas1-GFP-ya paqijkirî bi SDS-PAGE hate veqetandin û veguheztin nav parzûnek polîvînîlîden florîd (PVDF). Proteîn bi boyaxkirina PVDF-ê bi reşiya amîdê hate dîtin. Benda Gas1-GFP ji PVDF-ê hate qutkirin û 5 caran bi metanolê û carekê bi ava pola kromatografiya şile-MS (LC-MS) hate şuştin. Bi înkubasyona şerîta parzûnê bi 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), tampon û 500μl tevliheviya sodyûm nîtrîtê ya 1 M ya nû çareserkirî di 37°C de ji bo 3 saetan, fraksiyona lîpîd ji Gas1-GFP tê berdan û tê lîzkirin. Berdana seramîda fosfata înozînê di navbera glukozamîn û înozîtol de (51). Piştî vê yekê, şerîta membranê çar caran bi ava pola LC-MS hate şuştin, di germahiya odeyê de hate hişk kirin û heta analîzê di atmosferek nîtrojenê de di -80°C de hate hilanîn. Wekî kontrolek, ji bo her ceribandinê nimûneyek vala ya membrana PVDF hate bikar anîn. Dû re lîpîda ku ji Gas1-GFP hate derxistin bi MS-ê wekî ku hate vegotin (50) hate analîz kirin. Bi kurtasî, şerîtên PVDF-ê yên ku GPI-lîpîd dihewînin di 75μl çareserkera qalibê ya neyînî [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM asetata amonyûm] de ji nû ve hatin daliqandin û ji Analîza îyonîzasyona elektrospray (ESI)-MRM/MS ya cureyên sfîngolîpîdê (TSQ Vantage) derbas bûn. Di vê rewşê de, daneyên MS di moda îyonên neyînî de hatin bidestxistin.
Wekî ku berê jî hate gotin, beşa lîpîd a lengerê GPI ji GPI-AP-ya bi [3H]-înosîtol nîşankirî (16) hate veqetandin. Lîpîd bi kromatografiya tenik-qatî bi karanîna pergala çareserker (55:45:10 kloroform-metanol-0.25% KCl) hatin veqetandin û bi karanîna FLA-7000 (Fujifilm) hatin xuyang kirin.
Hucreyên ku Gas1-GFP (600×107) îfade dikirin du caran bi tampona TNE bi tampona TNE hatin şuştin, û bi mûyên cam hatin şikandin, û dû re hatin santrifujkirin da ku bermahiyên hucreyê û mûyên cam werin rakirin. Dûv re supernatant bi 17,000 g ji bo 1 saetê li 4°C hate santrifujkirin. Pelet di TNE de hate şuştin û bi 1 U PI-PLC (Invitrogen) di TNE de ku 0.2% saponîna dîjîtal tê de heye ji bo 1 saetê li 37°C hate înkubasyonkirin. Piştî dermankirina enzîmê, membran bi santrifujkirinê di 17,000 g de li 4°C ji bo 1 saetê hate rakirin. Ji bo îmûnopresîpîtasyona Gas1-GFP, supernatant bi GFP-Trap_A (ChromoTek) re di 4°C de tevahiya şevê hate înkubasyonkirin. Gas1-GFP-ya paqijkirî ya ku bi SDS-PAGE veqetandî bi şînê geş ê Coomassie hate boyaxkirin. Benda boyaxkirina Gas1-GFP ji gewrê derdora akveduktê hate qutkirin, û dûv re piştî alkîlasyonê bi îyodoasetamîdê û kêmkirinê bi dîtîotrîtol, di nav jelê de bi trîpsînê hate hilweşandin. Peptîdên trîptîk û peptîdan bi GPI-glîkanan derxînin û zuwa bikin. Peptîda zuwa di 20 μl avê de hate çareserkirin. Beşek (8 μl) têxin nav LC. Stûnek oktadesîlsîlan (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; çapa hundurîn 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japonya) ji bo veqetandina peptîdan di bin şert û mercên gradientê yên taybetî de hate bikar anîn. Qonaxa mobîl çareserkerê A (%0.08 asîda formîk) û çareserkerê B (%0.15 asîda formîk di%80 asetonîtrîl de) ye. Sîstemeke Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ji bo elutekirina stûnê bi çareserkerê A di nav 55 hûrdeman de bi rêjeya herikîna 50 μl min-1 ji bo 5 hûrdeman hate bikar anîn, û dûv re rêjeya çareserkerê B hate zêdekirin heta 40%. , Dewletên Yekbûyî yên Amerîkayê). Eluat bi berdewamî di çavkaniya îyonê ESI de hate danîn, û peptîdên trîptîk û peptîdên bi GPI-glîkanan re ji hêla LTQ Orbitrap XL (spektrometreya girseyî ya hîbrîd a îyona xêzikî-orbitrap; Thermo Fisher Scientific) ve hatin analîzkirin. Di sazkirina MS de, voltaja çavkaniya kapîlar li ser 4.5 kV hate danîn, û germahiya kapîlara veguhastinê li 300°C hate girtin. Voltaja kapîlar û voltaja lensa lûleyê bi rêzê ve li ser 15 V û 50 V hatin danîn. Daneyên MS di moda îyonên pozîtîf de (çareseriya 60,000; rastbûna girseyê 10 beş di mîlyonekê de) di rêjeya girseyê ya 300/m/z rêjeya girseyê/barkê (m/z) 3000 de hatin bidestxistin. Daneyên MS/MS bi rêya dafika îyonê ya di LTQ Orbitrap XL de [3 reqemên pêşîn ên ku daneyan pê ve girêdayî ne, veqetandina ji ber pevçûnê (CID)] têne bidestxistin.
Simulasyonên MD bi karanîna nermalava GROMACS (52) û qada hêzê ya MARTINI 2 (53-55) hatin kirin. Dûv re CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ji bo avakirina qatek duqatî ku dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) û Cer C18 an DOPC û Cer C26 tê de heye hate bikar anîn. Topolojî û kordînatên Cer C26 ji DXCE bi rakirina mûyên zêde ji dûvika sfingosine têne wergirtin. Pêvajoya ku li jêr hatî vegotin bikar bînin da ku qata duqatî hevseng bikin û wê bixebitînin, dûv re kordînatên dawîn ên pergalê bikar bînin da ku pergalek ku Emp24 tê de heye ava bikin. Domayna transmembranê ya hevîrtirşkê Emp24 (bermayiyên 173 heta 193) wekî α-helîksek bi karanîna avahiya molekulî ya amûra dîtbarî ya MD (VMD) (58) hate çêkirin. Dûv re, piştî rakirina lîpîdên hevûdu, proteîn bi qalindî hate granulkirin û bi karanîna CHARMM GUI hate danîn nav qata duqatî. Sîstema dawî 1202 DOPC û 302 Cer C26 an jî 1197 DOPC û 295 Cer C18 û Emp24 dihewîne. Sîstemê heta rêjeya 0.150M iyonîze bikin. Ji bo du pêkhateyên duqatî çar dubarekirinên serbixwe hatin çêkirin.
Qata duqatî ya lîpîd bi karanîna pêvajoya CHARMM GUI tê hevsengkirin, ku tê de kêmkirina û dûv re hevsengkirina 405,000 gavan heye, ku tê de sînorkirinên pozîsyonê hêdî hêdî kêm dibin û ji holê radibin, û gava demê ji 0.005 ps ber bi 0.02 ps ve tê zêdekirin. Piştî hevsengkirinê, ew 6 µs bi gava demê ya 0.02 ps çêdike. Piştî danîna Emp24, heman pêvajoya CHARMM GUI bikar bînin da ku pergalê kêm bikin û hevseng bikin, û dûv re ji bo 8 saniyeyan di hilberînê de bixebitin.
Ji bo hemû sîsteman, di dema pêvajoya hevsengkirinê de, zext ji hêla barostatê Berendsen (59) ve tê kontrolkirin, û di dema pêvajoya hilberînê de, zext ji hêla barostatê Parrinello-Rahman (60) ve tê kontrolkirin. Di hemû rewşan de, zexta navînî 1 bar e û nexşeya hevberdana zexta nîv-îzotropîk tê bikar anîn. Di pêvajoya hevsengkirin û hilberînê de, termostatek (61) bi ji nû ve kalibrasyona lezê tê bikar anîn da ku germahiya perçeyên proteîn, lîpîd û çareserker bi rêzê ve were hevber kirin. Di tevahiya operasyonê de, germahiya hedef 310K e. Têkiliya ne-girêdanê bi çêkirina navnîşek hevberdanê bi karanîna nexşeya Verlet bi toleransa tamponê ya 0.005 tê hesibandin. Terma Coulomb bi karanîna qada reaksiyonê û dûrahiya qutkirinê ya 1.1 nm tê hesibandin. Terma Vander Waals nexşeya qutkirinê bi dûrahiya qutkirinê ya 1.1 nm bikar tîne, û nexşeya qutkirina Verlet ji bo drifta potansiyel tê bikar anîn (62).
Bi karanîna VMD, dirêjahiya pêlê ya qutkirî di navbera morîkên fosfatê yên DOPC an morîkên seramîd AM1 û proteînê de 0.7 nm e, û hejmara lîpîdên ku bi proteînê re têkilî datînin tê hesibandin. Li gorî formula jêrîn, faktora kêmkirin-dewlemendkirinê (DE) wekî di (63) de hesab bikin: Faktora DE = (mîqdara lîpîdên tevahî di proteînê de 0.7) di proteînê de 0.7 (mîqdara Cer di lîpîdên tevahî de)
Nirxa ragihandî wekî navînî tê bidestxistin, û xetên çewtiyê çar kopiyên serbixwe yên SE ne. Girîngiya îstatîstîkî ya faktora DE bi testa t [(averageDE-factor-1)/SE] tê hesibandin. Nirxa P ji belavkirina yek-alî hesab bike.
Amûra GROMACS ji bo hesabkirina nexşeya dendika alî ya 2D ya pergala ku Emp24 di nav 250 ns-yên dawîn ên şopê de heye hate bikar anîn. Ji bo bidestxistina nexşeya dewlemendkirin/kêmkirina seramîdê, nexşeya dendika Cer bi berhevoka nexşeya Cer û DOPC tê dabeş kirin, û dûv re bi rêjeya Cer di laş de tê dabeş kirin. Pîvana nexşeya rengîn a heman tê bikar anîn.
Ji bo materyalên pêvek ên vê gotarê, ji kerema xwe li http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 binêrin.
Ev gotareke gihîştina vekirî ye ku li gorî şertên Lîsansa Creative Commons Attribution-Non-Commercial tê belavkirin, ku destûrê dide karanîn, belavkirin û hilberandinê di her medyayê de, heya ku karanîna dawîn ne ji bo berjewendiya bazirganî be û pêşgotin ew be ku xebata orîjînal rast be. Çavkanî.
Têbînî: Em tenê ji we dixwazin ku hûn navnîşana e-nameya xwe bidin da ku kesê ku hûn pêşniyarî rûpelê dikin bizanibe ku hûn dixwazin ew e-nameyê bibînin û ew ne spam e. Em ê tu navnîşanên e-nameyan negirin.
Ev pirs ji bo ceribandina ka hûn mêvan in û pêşîgirtina şandina otomatîkî ya spamê tê bikar anîn.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Auxiliadora Aguilera-Romero, AnanoS Perez Lopero, Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Wênekirina demrast a 3D ya bi çareseriya bilind girîngiya dirêjahiya zincîra seramîdê ji bo rêzkirina proteînê li deverên derketinê yên bijartî eşkere dike.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Auxiliadora Aguilera-Romero, AnanoS Perez Lopero, Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Wênekirina demrast a 3D ya bi çareseriya bilind girîngiya dirêjahiya zincîra seramîdê ji bo rêzkirina proteînê li deverên derketinê yên bijartî eşkere dike.
©2020 Komeleya Amerîkî ji bo Pêşveçûna Zanistê. hemû maf parastî ne. AAAS hevparê HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef û COUNTER e. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.