Spas ji bo serdana Nature.com. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgiriya CSS-ê bi sînor e. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî moda lihevhatinê di Internet Explorer-ê de vemirînin). Di vê navberê de, ji bo ku piştgiriya berdewam misoger bikin, em ê malperê bêyî şêwaz û JavaScript-ê nîşan bidin.
Berevajî movikdaran, tê bawerkirin ku kêzik hormonên steroîd ên cinsî yên ji hêla mêr ve têne piştgirîkirin tune ne. Di Anopheles gambiae de, steroîda ekdîzonê 20-hîdroksîekdîzon (20E) xuya dike ku ji bo kontrolkirina pêşveçûna hêkê dema ku ji hêla mêyan ve tê sentezkirin2 û ji bo destpêkirina serdemek berxwedêr a hevjînkirinê dema ku ji hêla nêr ve bi awayekî cinsî veguhezîne3 pêşketiye. Ji ber ku pêşveçûna hêkê û hevjînkirin taybetmendiyên bingehîn ên hilberînê ne, fêmkirina ka mêşhingivên Anopheles ên mê çawa van sînyalên hormonal entegre dikin dikare sêwirana bernameyên nû yên kontrolkirina malaryayê hêsan bike. Li vir, em eşkere dikin ku ev fonksiyonên hilberînê ji hêla steroîdên cinsî yên cihêreng ve bi rêya toreke tevlihev a enzîmên çalakker/neçalakker ên ekdîsteroîd têne rêve kirin. Me ekdîzonek oksîdekirî ya taybetî ya nêr, 3-dehîdro-20E (3D20E) nas kir, ku dê û bavtiyê bi girtina wergirtina cinsî ya jinan piştî veguhastina cinsî û çalakkirina bi defosforîlasyonê diparêze. Bi taybetî, veguhastina 3D20E her weha îfadeya genên hilberînê yên ku pêşveçûna hêkê di dema enfeksiyona Plasmodium de diparêzin çalak kir, tenduristiya mêyên vegirtî misoger kir. 20E ya ji mê hatî wergirtin têkiliyek cinsî dernaxe holê. bersiv, lê dihêle ku takekesên hevjîn piştî ku kînazên astengker ên 20E têne astengkirin hêkan bikin. Nasîna vê hormona steroîd a kêzikan a taybetî ya nêr û rola wê di rêkxistina wergirtina cinsî ya jinan, berhemdarî û têkiliya bi Plasmodium re potansiyela kêmkirina serkeftina hilberînê ya mêşên ku malaryayê vediguhezînin nîşan dide.
Ji ber berxwedana berfireh a mêşên Anopheles, ku yekane vektorê parazîtên malaryayê yên mirovan e, bûyerên malaryayê û mirinên wan dîsa zêde dibin4. Biyolojiya hevjînkirinê ya van mêşan ji bo destwerdanên nû yên kontrolkirina malaryayê armancek bi taybetî balkêş e ji ber ku mê tenê carekê hevjîn dibin5; sterîlkirina vê bûyera hevjînkirinê ya yekane dê potansiyelek mezin hebe ku nifûsa mêşan li zeviyê kêm bike.
Jin piştî wergirtina hormonên steroîd ên bi tîtra bilind ji mêran, ji hêla cinsî ve bêseqet dibin. Lêkolînan nîşan daye ku sedema dijwarbûna hevjîniya bêtir 20-hîdroksîkdîzon (20E) ye, hormonek steroîd ku di qonaxa larvayê de wekî rêkxerê çerxa moltingê tê zanîn. Şîyana nêran ji bo sentezkirin û veguhestina 20E bi taybetî di cureyên Anopheles de pêşketiye ku beşek ji bincinsê Cellia7 in, ku li Afrîkayê belav bûye û vektorên herî xeternak ên malaryayê, di nav de Anopheles gambiae jî, dihewîne. Ev bi taybetî girîng e ji ber ku di van cureyan de mê jî piştî her xwarina xwînê 20E hilberînin, û 20E çerxa oogenezê dimeşîne (li referansa 8 binêre). Lêbelê, hindik tê zanîn ka mê çawa sînyalên ji du çavkaniyên cûda yên ekdîzonê (veguheztina nêr û teşwîqkirina xwarina xwînê) bêyî ku şiyana xwe ya hevjîniyê xera bikin, entegre dikin. Bi rastî, heke 20E ya ku ji hêla mêyan ve hatî hilberandin bêtehamuliya cinsî çêbike, ev ê di kesên ku keçikên piçûk xwedî dikin de bibe sedema bêzarbûnê, tevgerînek pir gelemperî di van mêşan de5.
Şiroveyeke gengaz ew e ku nêrên A. gambiae ekdîzoneke guhertî ya taybetî ya nêr vediguhezînin, ku di rêça hilberandina jinan de kaskada sînyalan çalak dike, û di encamê de dibe sedema bêîstîqrariya hevjîniyê. Lêbelê, her çend vertebrates xwedî gelek hormonên steroîd in, wek estrogen û androgen (di referansa 9-an de hatine nirxandin), bi qasî ku em dizanin, steroîdên androjenîk-alîgir di kêzikan de nehatine tespît kirin.
Me dest bi destnîşankirina repertuwara hormonên steroîd di rijêna alîkar a nêr a nêr (MAG) ya A. gambiae ya gihîştî ya cinsî kir da ku steroîdên guherbar ên gengaz bibînin. Bi karanîna kromatografiya şilava performansa bilind bi spektrometriya girseyî ya tandem (HPLC-MS/MS) ve girêdayî, li şûna rêbaza kêmtir taybetî ya ku berê hatibû bikar anîn, me ekdîzon (E) û 20E di vê tevnê de tespît kirin, ku encama berê piştrast kir. Lêbelê, nimûne ji hêla steroîdên fosforîlkirî yên oksîdekirî ve serdest bû, ku li gorî formula 3-dehîdro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Wêne 1) ye. Formên din 3-dehîdro-20E (3D20E) û 20E-22-fosfat (20E22P) hene. Şiddeta sînyala HPLC-MS/MS ya 3D20E22P du rêz mezinahî ji forma wê ya defosforîlkirî, 3D20E, û sê rêz mezinahî ji ya E û 20E bilindtir bû (Wêne 1). Her çend di beşên din ên laş û jêrîn de rêça hilberandinê (LRT; Daneyên Berfireh Wêne 1a). Me her wiha ekdîsteroîdên di nêr û mêyên nû girtî (<1 rojî) de analîz kirin û 3D20E û 3D20E22P tenê di MAG de tespît kirin; E, 20E û 20E22P di her du zayendan de jî hebûn (Daneyên Berfireh Wêne 1b). Ev dane nîşan didin ku nêrên mezin ên A. gambiae di MAG-ên xwe de tîterên bilind ên hormonên guherîner çêdikin ku ji hêla mêyan ve nayên sentez kirin.
MAG û LRT ya mê (di nav de atrîum, vezîkulên seminal, û parovarium) ji nêrên 4 rojî (4 rojî) yên bakir û mêyên bakir û cotkirî (0.5, 3, û 12 hpm) hatin veqetandin. Ekdîzona di van tevnan de bi HPLC-MS/MS hate analîzkirin (navînî ± sem; testa t ya necotkirî, du alî, rêjeya kifşkirina derewîn (FDR) hate sererastkirin; NS, ne girîng; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 saet li hember 0.5 saetan, P = 0.035; 12 saet li hember 3 saetan, P = 0.0015; 12 saet li hember 0.5 saetan, P = 0.030. 3D20E22P: 3 saet li hember 0.5 saetan, P = 0.25; 12 saet li hember 3 saetan, P = 0.0032; 12 saet li hember 0.5 saetan, P = 0.015). Daneyên ji sê dubarekirinên biyolojîkî ne. Rûbera lûtkeyê ji bo her ekdîzona balkêş hate hesabkirin û bi hejmara mêşan hate normalîzekirin. Ekdîzon bi rengê jêrîn tê temsîlkirin: E, kesk; 20E, porteqalî; 20E22P, binefşî; 3D20E, şîn; 3D20E22P, pembe. Navber pîvanê li ser eksena y zêde dike da ku asta ekdîzonê ya nizmtir nîşan bide.
Ji bo lêkolîna ka 3D20E22P û 3D20E di dema hevjînkirinê de têne veguheztin an na, me LRT-yên mê di demên cûda yên piştî hevjînkirinê de parçe kirin. Her çend ekdîzon di keçikên bakir de nehat dîtin jî, me di cih de piştî hevjînkirinê (0.5 demjimêr piştî hevjînkirinê, hpm) di LRT-yê de mîqdarên girîng ên 3D20E22P dîtin, ku bi demê re kêm dibin, di heman demê de asta 3D20E bi girîngî zêde dibe (Wêne 1). Bi karanîna 3D20E-ya bi awayekî kîmyewî sentezkirî wekî standardek, me diyar kir ku asta vê hormona steroîd di LRT-yên hevjînkirinê de bi kêmî ve 100 carî ji 20E bilindtir bû (Tabloya Daneyên Berfireh 1). Bi vî rengî, 3D20E22P ekdîzona sereke ya nêr e ku di dema hevjînkirinê de vediguhezîne LRT-ya mê, û forma wê ya defosforîlekirî, 3D20E, di demek kurt de piştî hevjînkirinê pir zêde dibe. Ev rolek girîng ji bo ekdîzona paşîn di biyolojiya piştî hevjînkirinê ya mê de nîşan dide.
Piştî çêkirina komek daneyên rêza RNA ya nû (RNA-seq) (Wêne 2a), bi karanîna boriyek biyoenformatîkê ya xwerû, me li ekdîzon kînazê (EcK), ekdîzon oksîdazê (EO), û ekdîzonê geriya ku gena fosfatazê ya guhertî ya 20E kod dike. EPP) di tevnên hilberandinê de tê îfade kirin. Me yek gena EPP-ya namzet û du genên EcK-ya potansiyel (EcK1 û EcK2) destnîşan kir, lê nekarîn genek EO-ya namzet a baş bibînin. Bi taybetî, genên EPP-ya ferdî di astên bilind (sedî 98.9) de di MAG-ên Gambiyayê de hatin îfade kirin lê ne di LRT-yên jin de (Wêne 2b), berevajî hêviyên me ji ber ku defosforîlasyona 3D20E22P di vê tevna jin de çêbû. Ji ber vê yekê, em bawer dikin ku EPP-ya nêr dikare di dema hevjînkirinê de were veguheztin. Bi rastî, me nîşankirina îzotopên stabîl ên in vivo bikar anî da ku proteîna jin piştî hevjînkirinê veşêrin, enzîmek ku ji hêla MS ve di atriumê jin de hatî destnîşankirin (Wêne 2c û Tabloya Pêvek 1). Hebûna EPP di MAG û LRT ya mê ya hevjînkirî (lê ne bakire) de jî bi karanîna antîkorên taybetî hate piştrast kirin (Wêne 2d).
a, Xeta biyoenformatîkê ya bi taybetî hatî çêkirin ji bo lêgerîna şaneyên hilberandinê yên her zayendê ji bo genên ku kodên EcK, EO, û EPP dikin. Hejmarên li kêleka tîran hejmara namzetên nêr û mê di her gavê de nîşan didin. Vê analîzê yek gena EPP (EPP) û yek gena EcK (EcK1) ku di nêran de têne îfade kirin, û yek gena EcK (EcK2) ku di her du zayendan de tê îfade kirin lê gena EO ya namzet nade, destnîşan kir. b, Nexşeya germê ku îfadeya gena namzet di şaneyên Anopheles gambiae û Anopheles albicans ên bakir (V) û hevjînkirinê (M) de berawird dike. Spca, fertilîzasyon; MAG, rijênên alîkar di nêran de; beşên din ên laş, di nav de memik, bask, ling, laşên qelew, û organên navxweyî di her du zayendan de, û hêkdank di jinan de. EcK2 di hem MAG û hem jî di atrîumên Gambiya de pir zêde tê îfade kirin, lê EPP tenê di MAG de tê dîtin.c, Analîza proteomîk a veguheztina koma ejakulatê ya mêran nav atrîumên jinan de di 3, 12 û 24 hpm de, ku 67 proteînên herî zêde nîşan dide. Jin bi parêzek ku 15N tê de heye ji bo nîşankirin (û maskkirin) hemî proteînan hatine mezin kirin. Nêrên bê nîşankirî bi mêyên nîşankirî re hatin hevber kirin, û LRT-yên mê di 3, 12 û 24 hpm de ji bo analîza proteomîk hatin veqetandin (ji bo navnîşek bêkêmasî ya proteînên ejakulasyonê li Tabloya Pêvek 1 binêre). Di hundurê de, EPP, Eck1 û EcK2 di MAG-ya nêrên bakir de bi analîza proteomîk a van tevnan hatin tespît kirin.d, EPP bi western blot di MAG û LRT-ya mêyên hevberkirî de hate tespît kirin, lê ne di mêyên bakir an nêr an jî mayî ya mê de. laş. Membran di heman demê de bi antîkorên antî-aktîn (kontrola barkirinê) û antî-EPP hatin lêkolînkirin. Hemû nêr bakir in. Ji bo daneyên çavkaniya jelê li Wêneya Pêvek 1 binêre. Western blot du caran bi encamên wekhev hatin kirin.
Çalakiya fosfofosfataza ekdîsteroîd a EPP piştî înkubasyonê bi HPLC-MS/MS bi 3D20E22P ya ji MAG veqetandî hate verast kirin (Daneyên Berfireh Wêne 2a). Wekî din, dema ku me EPP bi destwerdana RNA-navbeynkar (RNAi) bêdeng kir, me kêmbûnek bihêz di çalakiya fosfatazê de di tevnên hilberandina van nêran de tespît kir (Wêne 3a), û mêyên ku bi nêrên bêdengkirî yên EPP re hevjîn bûn, rêjeyek girîng a kêmtir a 3D20E ya defosforîlkirî (Wêne 3b) tevî bêdengkirina qismî ya genê nîşan dan (Daneyên Berfireh Wêne 2b,c). Berevajî vê, me di heman mêşan de guhertinên girîng di rêjeya 20E22P/20E de tespît nekirin, ku dibe ku nîşan bide ku enzîm ji bo 3D20E22P taybetî ye (Wêne 3b).
a, Kêmbûna çalakiya fosfatazê di MAG de ji ber bêdengkirina EPP bi karanîna kontrolên RNA EPP ya du-tevlî (dsEPP) an RNA GFP ya du-tevlî (dsGFP) çêbûye. Di her dubarekirinê de bîst komên MAG hatin bikar anîn (P = 0.0046, testa t-ya cotkirî, du-alî), ku bi xalên cuda têne temsîl kirin.b, Mêyên ku bi nêrên bêdengkirî yên EPP re cot bûne, rêjeyek pir kêmtir a 3D20E ya defosforîlkirî li 3 hpm hebû (P = 0.0043, testa t-ya necotkirî, du-alî), lê astên 20E nebandor bûn (P = 0.063, necotkirî). testa-t, du-alî). Daneyên wekî navînî ± sem ji sê komên 13, 16 û 19 mêyan têne pêşkêş kirin.c, Mêyên ku bi nêrên bêdengkirî yên EPP re hevjîn bûne rêjeyên hevjînkirina ji nû ve bi awayekî girîng bilindtir hebûn (P = 0.0002, testa rast a Fisher, du-alî). Pêşî mê neçar man ku hevjîn bikin da ku rewşa hevjîniya xwe misoger bikin; 2 roj şûnda, ew bi nêrên din ên ku spermên transjenîk hildigirtin re hatin têkilîkirin da ku rêjeyên ji nû ve hevjînkirinê bi tespîtkirina PCR-ya hejmarî ya transgenê werin nirxandin.d, Mêyên ku bi xwînxwarinê re hevjîn bûne û bi nêrên bêdengkirî yên EPP-ê re hevjîn bûne, berhemdariya wan bi girîngî kêm bûye (P < 0.0001; testa Mann-Whitney, du-alî) û hejmara hêkan hinekî kêm bûye (P = 0.088, testa Mann-Whitney, du-alî), di heman demê de rêjeya hêkdanê bandor lê nebûye (P = 0.94, testa rast a Fisher, du-alî). Di hemî panelan de, n hejmara nimûneyên mêşan ên biyolojîkî serbixwe temsîl dike.NS, ne girîng e.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Piştre, me nirxand ka defosforîlasyona ecdysone ji bo çêkirina berxwedana hevjînkirinê di mêyan de girîng e an na. Bi taybetî, mêyên ku bi nêrên bê EPP re hevjîn bûne, dema ku bi nêrên din (transgenîk) re rû bi rû mane, bi frekansek pir zêdetir (44.9%) ji mêyên kontrolê (10.4%) ji nû ve hevjîn bûne (Wêne 3c). Me her weha kêmbûnek girîng di berhemdariyê de dît (Wêne 3d, çep) û kêmbûnek sivik di hejmara hêkên ku ji hêla van mêyan ve hatine danîn de (Wêne 3d, navîn), di heman demê de rêjeya hêkên ku ji hêla mêyan ve hatine danîn (bersivek din ku di mêyan de bi hevjînkirinê çêdibe )) bandor nebû (Wêne 3d, rast). Bi saya taybetmendiya çavdêrîkirî ya EPP ji bo 3D20E22P, ev encam nîşan didin ku aktîvkirina 3D20E ji hêla EPP ve di dema hevjînkirinê de hatî veguheztin dibe ku rolek girîng di vemirandina pêşwaziya mêyan de ji bo hevjînkirina bêtir bilîze, tevgerek ku berê bi veguhastina cinsî ya 20E ve dihat vegotin. Ji ber vê yekê, ev hormona taybetî ya nêr jî bi tundî bandorê li ser berhemdariya mêyan dike.
Piştre, me çalakiyên 20E û 3D20E di ceribandinên derzîkirinê de li ser keçikên gihîştî yên cinsî bi karanîna 3D20E ya bi awayekî kîmyayî sentezkirî (Wêne 4a-c) û 20E ya bazirganî berdest berhev kirin. Me dît ku 3D20E di rawestandina hesasiyeta mêyan a ji bo hevjînkirinê de di her du dendikan de ji 20E bi girîngî bandorkertir bû (Wêne 4d). Bi taybetî, nîvê asta fîzyolojîk a 3D20E di LRT de (1,066 pg piştî derzîkirinê li hember 2,022 pg piştî hevjînkirinê) rêjeyek ji mêyên bêberxwedêr çêkir ku 20 qat ji asta fîzyolojîk a 20E (361 pg piştî derzîkirinê) 24 demjimêran piştî derzîkirinê di dendika herî bilind 18 pg piştî hevjînkirinê de 20 qat bilindtir bû; Tabloya Daneyên Berfireh 1). Ev encam lihevhatî ye bi wê ramanê ku veguhastina cinsî ya 20E dibe sedema demên refraktor ên hevjînkirinê, û bêtir 3D20E wekî faktorek sereke di misogerkirina têkiliya dêûbav-zarok de destnîşan dike. 3D20E di ceribandinên hêkdanînê yên mêyên bakir de ji 20E pir çalaktir bû (Wêne 4e), ku ev yek nîşan dide ku rêjeya hêkdanîna normal a ku me piştî bêdengkirina qismî ya EPP dît, ji ber hebûna çalakiya 3D20E ya mayî bû ku hîn jî ji hêla faktorên mê yên ji ber hevjînkirinê ve têne hilberandin.
(a,b) 3D20E bi awayekî kîmyayî ji 20E hatiye sentezkirin (a) bi veguherîn/karîgeriyeke pir bilind (dane wekî navînî ± sem ji sê reaksiyonên senteza serbixwe hatine pêşkêşkirin) (b).c, Spektrumê girseyî (nîvê jêrîn) bi tevahî bi ekdîzonê re li hev tê ku di LRT-ya mê ya hevjînkirî de tê dîtin (nîvê jorîn).d, Li gorî 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; testa rast a Fisher, du-alî) û 10% etanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; testa rast a Fisher, du-alî), di heman demê de 20E tenê di dozên bilindtir de ji kontrolê bi girîngî bilindtir bû (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; testa rast a Fisher, 2-alî).e, derzîkirina 3D20E ya çêkirî rêjeyên hêkdanê yên mêyên bakir ên pir bilindtir ji kontrolên 10% etanolê (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; testa rast a Fisher, du-alî), lê 20E li gorî kontrolên Tenê di dozên bilindtir de (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; testa rast a Fisher, du-alî).3D20E rêjeyên hêkdanê yên pir bilindtir ji 20E di dozên bilindtir de çêkir (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; testa rast a Fisher, du-alî).Di hemî panelan de, n hejmara nimûneyên mêşên biyolojîkî serbixwe temsîl dike.NS, ne girîng e.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Daneyên ji sê ne. dubare dike.
Di lêkolînên berê de, me dît ku veguhestina cinsî ya hormonên steroîd îfadeya MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) çalak dike, genek hilberandina jinan ku jinên A. gambiae ji enfeksiyona P. falciparum diparêze. Mesrefên tenduristiyê yên ji hêla 13, parazîta malaryayê ya herî kujer a mirovan ve têne çêkirin. Ji ber girîngiya MISO ji bo fîtnesa hilberandina Anopheles li deverên endemîk ên malaryayê, me biryar da ku diyar bikin ka kîjan hormon 3D20E an 20E îfadeya vê genê çalak dike. Me dît ku her çend derzîkirina 20E bi taybetî an jî bi hêztir hin wergirên hormona navokî (HR), wekî HR3 û HR4, û hedefên steroîd ên tîpîk ên jêrîn, wekî genên zerkojenîk Vg14, 15, 16 çalak kir, MISO ji hêla 3D20E ve bi hêztir hate çalak kirin (Daneyên Berfireh Wêne 3). Bi vî rengî, veguhastina cinsî ya vê hormona steroîd a androjenîk xuya dike ku mekanîzmayên ku jinan ji mesrefên ku ji hêla enfeksiyona parazît ve têne çêkirin diparêzin çalak dike. Wekî din, 3D20E bi awayekî cûda bandorê li her du îzoforman dike. ya wergirê E EcR, EcR-A çalak dike û EcR-B tepeser dike, û genên din ên ku hevjîniyê çalak dikin, di nav de HPX15, ku bandorê li ser berhemdariya jinan dike, bi hêztir çalak dike. Ev dikare bêzariya girîng a ku di jinên ku bi mêrên bêdengkirî yên EPP re hevjîn bûne de tê dîtin rave bike (Daneyên Berfireh Wêne 3). Ev dane hebûna rêyên jêrîn ên ku bi tercîhî ji hêla du hormonên ekdîzonê ve têne çalak kirin ku dibe ku bingeha fonksiyona taybetî ya zayendî bin, pêşniyar dikin.
Piştre, me fonksiyona du genên EcK yên ku di xeta me ya biyoenformatîkê de hatine destnîşankirin ceriband. Bêdengkirina EcK1 an EcK2 bû sedema mirina girîng li mêran (Daneyên Berfireh Wêne 4a), ku ev yek nîşan dide ku fosforîlasyona ecdysone, û bi vî rengî bêçalakkirin, ji bo zindîmanê girîng e. Ji ber ku EcK2 di astên bilindtir de ji EcK1 hate îfade kirin û di MAG-an de bi proteomîkê hate tespît kirin (Wêne 2b,c û Tabloya Pêvek 2), me çalakiya wê ya ecdysteroid kinase bi înkubasyona wê bi 20E re piştrast kir, ku ev yek bû sedema fosforîlasyona 20E22P (Daneyên Berfireh Wêne 2).4b). Dema ku 3D20E wekî substratek bikar anîn, em nekarîn hilbera fosforîlkirî 3D20E22P tespît bikin (Daneyên Berfireh Wêne 4c), ku ev yek nîşan dide ku dibe ku 20E li şûna 3D20E hedefa bijarte ya EcK2 be.
Li gorî analîza me ya RNA-seq, EcK2 di LRT ya keçikên mê yên bakir de jî pir zêde dihat îfadekirin, ku piştî hevjînkirinê ew hate vemirandin (Wêne 2b). Me ev dane piştrast kirin û diyar kir ku îfadeya EcK2 ji hêla xwarina xwînê ve nehatiye bandor kirin (Daneyên Berfireh Wêne 5a). Bi berfirehkirina ceribandinên me yên destpêkê yên MS, me diyar kir ku lûtkeya 20E22P bi lûtkeya 20E ve girêdayî ye (22-26 demjimêr piştî xwarina xwînê; Daneyên Berfireh Wêne 5b). Bêdengkirina EcK2 di keçikên mê yên bakir de bû sedema zêdebûna 3-qatî di rêjeya nisbî ya 20E bi 20E22P re di 26 demjimêran piştî xwarina xwînê de (Wêneyên Daneyên Berfireh 2c û 5c), ku piştrast dike ku EcK2 di keçan de jî 20E fosforîle dike. Bi taybetî, keçikên bê EcK2 wergirtina cinsî ya tevahî parastin (Daneyên Berfireh Wêne 5d,e), ku bêtir pêşniyar dike ku hilberîna mê ya 20E serdemên refraktor ên hevjînkirinê çênake. Lêbelê, van mêyan rêjeyên hêkdanê li gorî komên kontrolê bi awayekî berbiçav zêde bûn, ji %30 zêdetir keçikên bakir hêk dikirin (Daneyên Berfireh Şekil 5f). Ger piştî xwarina xwînê derzîkirina RNAya Eck2 ya duqatî (dsEcK2) hatiba kirin, hêkdan çênebû, di vê nuqteyê de lûtkeya 20E ji ber vexwarina xwînê kêm bûbû. Bi tevayî, ev encam piştgirî didin modelek ku 20E ya piştî rijandina xwînê hilberandî dikare hêkdanê teşwîq bike, lê tenê dema ku bloka hêkdanê (EcK2 û dibe ku faktorên din) bi hevjînkirinê ve were vemirandin. Ne derzîkirina 20E û ne jî derzîkirina 3D20E îfadeya EcK2 di keçikên bakir de asteng nekir (Daneyên Berfireh Şekil 5g), ku ev yek nîşan dide ku faktorên din astengkirina vê kînazê navbeynkar dikin. Lêbelê, asta 20E piştî xwarina xwînê ji bo çêkirina nerehetiya hevjînkirinê ne bes bû, lê bi bandor ji hêla tîterên bilind ên 3D20E yên bi rêya cinsî veguheztî ve hatin çalak kirin.
Encamên me têgihîştinên girîng li ser mekanîzmayên ku serkeftina hilberînê ya A. gambiae rêk dixin peyda dikin. Modelek derketiye holê ku nêr pêşketiye da ku tîterên bilind ên 3D20E sentez bike, ekdîzonek guhertî ya taybetî ya nêr ku bi bêhesaskirina mêyan ji bo hevjîna bêtir dê û bavtiyê misoger dike. Di heman demê de, van vektorên malaryayê jî pergalek bi bandor pêşxistiye da ku 3D20E di mêyan de çalak bike di bersiva veguhastina cinsî ya EPP-ya taybetî ya nêr de. Bi zanîna me, ev mînaka yekem a pergalek hormona steroîd a ku nêr û mê serdest in e ku fonksiyonek bêhempa û krîtîk di kêzikan de pêk tîne. Fonksiyona ekdîzona taybetî ya nêr hatiye texmîn kirin lê bi awayekî teqez nehatiye nîşandan. Mînakî, hîpotezek bi piranî redkirî 18 ev e ku ev fonksiyon dikarin ji hêla pêşengê 20E E1 ve werin kirin. Baş tê zanîn ku di Drosophila de, monandry ji hêla veguhastina cinsî ya peptîdên cinsî yên piçûk ve tê çalak kirin 19,20 ku bi neuronên ku rêça hilberînê ya mê bi rêya receptorên peptîdên cinsî yên taybetî ve girêdayî ne 21,22 re têkilî daynin. Xebata bêtir hewce ye ku rêbaza jêrîn were destnîşankirin. kaskadên sînyalan ên ku ji hêla 3D20E ve di mêyên A. gambiae de têne kontrol kirin û ji bo destnîşankirina ka gelo ev kaskad dikarin di navbera mêşan û Drosophila de werin parastin.
Ji ber rola girîng a 3D20E li ser berhemdarî û tevgerên jinan ku di lêkolîna me de hatine destnîşankirin, rêyên ku dibin sedema sentez û aktîvkirina 3D20E ji bo stratejiyên kontrolkirina mêşan ên pêşerojê derfetên nû pêşkêş dikin, wek mînak çêbûna nêrên sterîl ên pêşbazker di stratejiyên teknolojiya kêzikên sterîl de. Bikaranîna ji bo berdana kovî an jî teqlîdkirina 3D20E di lîstika bakir de. Fonksiyona taybetî ya nêr a 3D20E dibe ku dema ku A. gambiae û cureyên din ên Cellia şiyana koagulkirina sperma xwe di nav pêvekên hevjînkirinê de bi dest xistine pêşketibe, ji ber ku ev dihêle ku hejmareke mezin ji hormon û enzîmên aktîvker ên hormonê bi bandor veguhezîne. Di encamê de, pêşveçûna 3D20E ya ku monandry pêk tîne mekanîzmayek ji bo jinan peyda dike (bi rêya îfadeya bilind a MISO) da ku şiyana wan a hilberandinê li deverên ku rêjeya malaryayê bilind e, baştir bike, ku nerasterast beşdarî veguhestina Plasmodium dibe. Ji ber ku hatiye nîşandan ku mê 20E bandorên kûr li ser jiyan û mezinbûna P. falciparum di mêşên Anopheles ên mê de dike,24 hem rêyên hormona steroîd a nêr û hem jî ya mê niha aliyên sereke yên têkiliyên mêş-parazît in.
Şêweyên A. gambiae G3 di bin şert û mercên standard ên kêzikan de (26-28 °C, şilbûna nisbî 65-80%, fotoperiyod 12:12 demjimêr ronahî/tarî) hatin xwedîkirin. Larva bi xwarina masiyên tozkirî (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets û Tetra Pond Sticks bi rêjeya 7:7:2) hatin xwedîkirin. Mêşên mezin bi çareseriya dekstrozê ya 10% ad libitum û xwîna mirovan a heftane (pêkhateyên xwînê yên lêkolînê) hatin xwedîkirin. Mêşên virgin bi veqetandina cinsan di qonaxa pupal de piştî lêkolîna dawiyan bi mîkroskopiyê hatin bidestxistin. Nêrên ku transgena DsRed hildigirin berê hatine vegotin.
Ceribandinên hevjînkirina bi zorê li gorî protokolên ku berê hatine vegotin hatin kirin. Ji bo hevjînkirina xwezayî, mêyên bakir ên 4 rojî bi nêrên bakir ên gihîştî yên zayendî re du şevan di rêjeya 1:3 de hatin hiştin. Ji bo ceribandinên ku dsEPP ji nêran re hat derzîkirin, hev-qefesgirtin bi rojên 3-4 piştî derzîkirinê re hevdem bû, dema ku çalakiya fosfatazê herî zêde bêdeng bû (Daneyên Berfireh Wêne 2b).
Teşeyên mêşan, kadavrên mayî (mayîna laş), an tevahiya laş di nav 100% metanolê de hatin parçekirin û bi beader (mûrên cam ên 2 mm, 2,400 rpm, 90 saniye) hatin homojenîzekirin. Mîqdara teşeyan û qebareya metanolê wiha bûn: mayîya laş, 50 di 1,000 µl de; MAG, 50–100 80 µl; LRT ya mê, 25–50 80 µl. Bermayî bi heman qebareya metanolê re ji bo derxistina metanolê ya duyemîn hat derbaskirin. Bermahiyên şaneyan bi santrifujkirinê hatin rakirin. Metanola ji her du derxistinan hat tevlihevkirin û di bin herikîna nîtrojenê de hat hişkkirin, dûv re di qebareyên jêrîn ên 80% metanolê di avê de ji nû ve hat daliqandin: mayîya laş, 50 µl; MAG û LRT ya mê, 30 µl.
Nimûne li ser spektrometreyeke girseyî (ID-X, Thermo Fisher) ku bi amûreke LC (Vanquish, Thermo Fisher) ve girêdayî ye hatin analîzkirin. 5 µl ji nimûneyê li ser stûneke 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) ku di 25°C de hatiye parastin, hat şandin. Qonaxên mobîl ji bo LC A (av, 0.1% asîda formîk) û B (asetonîtrîl, 0.1% asîda formîk) bûn. Gradienta LC wiha bû: 5% B ji bo 1 deqîqeyê, dûv re di nav 11 deqîqeyan de heta 100% B zêde bû. Piştî 8 deqîqeyan li 100%, stûnê ji bo 4 deqîqeyan li 5% B ji nû ve hevseng bikin. Rêjeya herikînê 0.3 ml min-1 bû. Îyonîzasyon di çavkaniya MS de bi îyonîzasyona elektrospray a germkirî di modên erênî û neyînî de tê kirin.
Spektrometra girseyî daneyan di navbera m/z de ji 350 heta 680 bi çareseriya 60,000 di moda MS ya tevahî de dipîve. Daneyên MS/MS li ser [M + H]+ (hemû hedef), [M - H2O + H]+ (hemû hedef), û [M - H]- (hedefên fosforîlkirî) hatin bidestxistin. Daneyên MS/MS ji bo piştrastkirina taybetmendiyên ekdîzonê yên hedefên ku ji bo wan standard tune bû hatin bikar anîn. Ji bo destnîşankirina ekdîsteroîdên ne-hedefkirî, daneyên MS/MS ji bo hemî lûtkeyên HPLC bi pirbûna nisbî ya >15% hatin analîz kirin. Bi karanîna xêzên standard ên ku ji standardên paqij (20E, 3D20E) hatine çêkirin, hejmar bikin da ku mîqdarên mutleq an jî dilopkirinên nimûneyek taybetî (hemû hedefên din) hesab bikin da ku wekheviya wan bi mîqdarên ku di mêrekî de hatine dîtin hesab bikin. Ji bo 3D20E, hejmartin bi karanîna berhevoka adduktên jêrîn hate kirin: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Daneyên hatin derxistin û bi karanîna Tracefinder (guhertoya 4.1) hatin hejmartin. Daneyên MS/MS bi karanîna Xcalibur (guhertoya 4.4) hatin analîzkirin. Spektrên MS yên E, 20E û 3D20E bi standardên têkildar re hatin berhev kirin. 3D20E22P bi derivatîzasyonê bi reaktîfa Girard re hate analîzkirin. 20E22P bi rêjeya m/z hate analîzkirin.
3D20E22P ji MAG hate paqijkirin. Paqijkirin li ser pîvanek analîtîk bi karanîna kromatografek şilavê ya ultra-performans (Acquity, Waters) bi detektorek bingehîn a girseya çar-polî (QDa, Acquity, Waters) di heman şert û mercên LC de wekî analîza HPLC-MS/MS hate kirin. Berhevkirina fraksiyonê hate destpêkirin dema ku m/z ya ku bi 3D20E22P re têkildar e di heman dema ragirtinê de wekî ku berê hatî destnîşankirin hate tespît kirin. Paqijiya pêkhateyên derxistî dûv re bi HPLC-MS/MS wekî ku li jor hatî vegotin hate kontrol kirin.
RNAya giştî ji 10-12 tevnên hilberandinê an beşên din ên laş (bê serî) bi karanîna reaktîfa TRI (Thermo Fisher) li gorî rêwerzên çêker hate derxistin. RNA bi TURBO DNase (Thermo Fisher) hate dermankirin. cDNA bi karanîna transkrîptaza berevajî ya vîrusa losemiya mişkî ya Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) li gorî rêwerzên çêker hate sentezkirin. Prîmer ji bo PCR-ya hejmarî ya transkrîpsiyona berevajî (RT-qPCR; Tabloya Daneyên Berfirehkirî 2) berê hatine weşandin24 an jî bi karanîna Primer-BLAST26 hatine sêwirandin, bi tercîh ji bo hilberên bi mezinahiya 70-150 bp û girêdanên ekson-eksonê vedihewîne an jî prîmerên cotek prîmer eksonan ji hev vediqetînin. Nimûneyên cDNA ji sê heta çar dubarekirinên biyolojîkî ji bo RT-qPCR çar qat di avê de hatin şilkirin. Pîvandin di reaksiyonên dubare yên 15 µl de hate kirin ku 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), prîmer, û 5 µl cDNA-ya şilkirî tê de hebûn. Reaksiyon li ser QuantStudio hatin meşandin. 6 Sîstema PCR-ya demrast a Pro (Thermo Fisher) û daneyên wê bi karanîna Design and Analysis (guhertoya 2.4.3) hatin berhevkirin û analîzkirin. Wekî ku di vê lêkolînê de hatiye nîşandan, mîqdarên nisbî li gorî gena rîbozomal RpL19 (AGAP004422) hatin normalîzekirin, ku îfadeya wê bi xwarina xwînê 27 an jî hevjînkirinê 3 re bi girîngî neguherî.
Kalîteya RNAyê bi karanîna Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) hate kontrolkirin. Pirtûkxaneyên Illumina yên dawiya cotkirî li Enstîtuya Broad a MIT û Harvardê hatin amadekirin û xebitandin. Xwendinên rêzkirinê bi genoma A. gambiae (şaneya PEST, guhertoya 4.12) bi karanîna HISAT2 (guhertoya 2.0.5) bi parametreyên xwerû hatin hevrêzkirin. Xwendinên bi puanên kalîteya nexşekirinê (MAPQ) <30 bi karanîna Samtools (guhertoya 1.3.1) hatin rakirin. Hejmara xwendinên ku bi genan ve hatine nexşekirin bi karanîna htseq-count (guhertoya 0.9.1) bi parametreyên xwerû hate hejmartin. Jimareyên xwendinê yên normalîzekirî hatin hesabkirin û îfadeya genê ya cûda bi karanîna pakêta DESeq2 (guhertoya 1.28.1) di R (guhertoya 4.0.3) de hate analîzkirin.
Namzetên genên guherker ên Ecdysone bi pêşî lêgerîna genoma A. gambiae bi karanîna algorîtmaya PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), bi karanîna nirxên xwerû yên Parametreyan bi rêzikên proteîna lêpirsînê yên jêrîn hatin destnîşankirin: ji Bombyx mori (Hejmara Gihîştinê NP_001038956.1), Musca domestica (Hejmara Gihîştinê XP_005182020.1, XP_005175332.1 û XP_011294434.1) û Microplitis demolitor (Hejmara Gihîştinê XP_008552646.1 û XP_008552645.1) EcK ji B. mori (Hejmara Gihîştinê NP_001036900), Drosophila melanogaster (Hejmara Gihîştinê NP_651202), Apis. mellifera (Hejmara Gihîştinê XP_394838) û Acyrthosiphon pisum (Hejmara Gihîştinê XP_001947166); û EPP ji B. mori (Hejmara Gihîştinê XP_001947166) NP_001177919.1 û NP_001243996.1) û EO ya D. melanogaster (Hejmara Gihîştinê NP_572986.1) (gava 1). Piştre, fîlter li gorî îfadeya mRNA ya bilind (>100 perçe/kîlobaz ekson di her milyon xwendinên nexşandî de (FPKM) an >85%) di tevna hilberandinê de (LRT an MAG ya mê) li Gambiya (gava 2). Ji bo baştirkirina taybetmendiyê, me enzîmên namzed hilbijartin ku di tevna hilberînê ya A. albimanus de jî têne îfade kirin, cureyek anopheles e ku di dema çêjkirinê de ekdîzonê sentez nake an naguhezîne. Genên namzed li gorî îfadeya kêm (<100 FPKM an <85emîn sedî) di tevna hilberînê ya A. albimanus de hatin fîltrekirin (gava 3). Wekî fîlterek dawîn (gava 4), genên namzed hewce ne ku herî kêm yek ji van şertan bicîh bînin: (1) piştî çêjkirinê bi girîngî zêde bûne (P < 0.05) li gorî analîza genên bi awayên cûda hatine îfadekirin û (2) di tevnên ne-çêjkirinê de (< 85% an <100 FPKM).
Me rêbazên berê hatine vegotin 28,29,30 guhertin da ku nîşankirina îzotopîk a tevahiya organîzmayê bi dest bixin. Bi kurtasî, Saccharomyces cerevisiae ya celebê II ya celebê kovî (YSC2, Sigma) di bingeha nîtrojena hevîrtirşkê (BD Difco, DF0335) de ku tê de (wt/vol) 2% glukoz (G7528, Sigma), 1.7% bê asîda amînî û sulfata amonyûmê (malzemeya çandiniyê) û 5% sulfata amonyûmê 15N (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) wekî çavkaniya yekane ya nîtrojenê heye, hate ceribandin. Hevîrtirşk bi santrifujkirinê hate wergirtin û larvayên mêşan heta ku pupasyon bibin ad libitum hatin xwarin. Ji bo pêşîgirtina li mirina qonaxa çaremîn bi arvanê masî (0.5 mg ji bo her 300 larvayan) lê zêde bikin. Dûv re tenê mê di ceribandinên hevjînkirinê de bi nêrên bê nîşan hatin bikar anîn da ku proteoma nêr a di dema hevjînkirinê de hatî veguheztin analîz bikin.
Jinên mê yên 4-6 rojî yên bi nîşana 15N neçar man ku bi nêrên mê yên mê yên ne nîşankirî yên hevberkirî re hevjîn bikin. Hevjînkirina serketî bi tespîtkirina pêvekên hevjînkirinê di bin mîkroskopa epifluoresansê de hate verast kirin. Di 3, 12, û 24 hpm de, atrîûmên 45-55 mêyên hevjînkirî di nav 50 µl tampona bîkarbonat amonyûm (pH 7.8) de hatin parçekirin û bi pestleyê homojen kirin. Homogenat hate santrifuj kirin û supernatant bi 50 µl RapiGest 0.1% (186001860, Waters) di bîkarbonat amonyûm 50 mM de hate tevlihev kirin. Supernatant û pelet ji her nimûneyê li ser qeşayê hişk hatin cemidandin û şevekê ji bo laboratuwara MacCoss li Zanîngeha Washingtonê hatin şandin, li wir amadekirina nimûneyê ji bo LC-MS/MS hate temam kirin. Peletê di 50 µl RapiGest 0.1% di bîkarbonat amonyûm 50 mM de ji nû ve bihelînin û di hemamek avê de bi sonîkasyonê bikin. Têkeliya proteîna pelet û supernatantê bi ceribandina BCA hate pîvandin, nimûne bi 5 mM dîtîotrîtol (DTT; Sigma) hatin kêmkirin, bi 15 mM îyodoasetamîd (Sigma) hatin alkîlkirin û di 37°C (1:0 50) de ji bo 1 saetê bi trîpsînîzasyon: rêjeya trîpsîn:substrat hatin înkubasyonkirin. RapiGest bi zêdekirina 200 mM HCl hate lîzkirin, dû re di 37°C de ji bo 45 deqîqeyan û di 14,000 rpm de ji bo 10 deqîqeyan di 4°C de ji bo rakirina bermayiyan hate înkubasyonkirin. Nimûne bi derxistina qonaxa zexm a du-modî (kartuşên Oasis MCX, Waters) hatin şuştin û di 0.1% asîda formîk de ji bo têkeliya proteîna dawîn a 0.33 µg µl-1 ji nû ve hatin sûspendekirin. Proteomên MAG ên bê nîşankirin bi heman rengî ji nêrên bakir hatin analîzkirin. Du dubarekirinên analîtîk ji bo her nimûneyê hatin analîzkirin. Piştre, 1 µg ji her yekê hate analîzkirin. bi karanîna stûnek sîlîkaya helandî ya 25 cm 75-μm bi dafikek fritê ya Kasil1 (PQ) ya sîlîkaya helandî ya 4 cm ku bi rezîna qonaxa berevajî ya Jupiter C12 (Phenomenex) û kromatografiya şile ya 180-deqîqeyî hatiye dagirtin. Dabeşkirinên nimûneyan - MS/MS li ser spektrometreya girseyî ya Q-Exactive HF (Thermo Fisher) bi Sîstema nanoACQUITY UPLC (Waters) hate xebitandin. Daneyên bidestxistina daneyan ên têkildarî ku ji bo her xebitandinê hatine çêkirin, bi karanîna Proteowizard (guhertoya 3.0.20287) û bi karanîna Comet31 (guhertoya 3.2) li dijî databasa FASTA ku rêzikên proteînê ji Anopheles gambiae (guhertoya VectorBase 54), Anopheles coluzzi dihewîne, hatin veguheztin formata mzML. Lêgerînek li ser Mali-NIH (guhertoya VectorBase 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Adar 2021), A. gambiae RNA-seq, û wergerên sê-çarçove yên gemarên mirovan ên naskirî hate kirin. FDR-yên lihevhatî yên nexşeya peptîdê bi karanîna Percolator32 (guhertoya 3.05) bi eşikek 0.01 hatin destnîşankirin, û peptîd bi karanîna parsimony proteînê di Limelight33 (guhertoya ...) de di nasnameyên proteînê de hatin kom kirin. 2.2.0). Pirbûna proteîna nisbî bi karanîna faktora pirbûna spektral a normalîzekirî (NSAF) ku ji bo her proteînê di her ceribandinê de wekî ku berê hatiye vegotin hatiye hesibandin, hate texmîn kirin. NSAF-a nisbî ya her proteînê li ser nimûneyên ji du dubarekirinên biyolojîkî yên cûda hate navînî kirin. Etîketkirina 15N proteoma mê bi serkeftî veşart, her çend mîqdarek piçûk ji proteîna bê etîket ji bakirên etîketkirî hate tespît kirin. Me tespîtkirina kêmkirina proteîna nêr (1-5 spektrum) di nimûneyên xav ên mê de tenê di ceribandinên teknîkî de tomar kir, ku nimûneyên xav piştî nimûneyên nêr/hevjînkirinê hatin xebitandin, wekî encamek "hilgirtina HPLC". Proteînên carinan ên ku wekî 'gemarî' ji bakirên etîketkirî têne dîtin di Tabloya Pêvek 1 de têne navnîş kirin.
Du peptîdên antîjenîk, QTTDRVAPAPDQQQ (di nav îzotipa PA de) û MESDGTTPSGDSEQ (di nav îzotipa PA û PB de) di Genscript de. Her du peptîd hatin hev kirin, dûv re bi proteîna hilgir KLH ve hatin konjugasyon kirin û di nav kêvroşkên Zelanda Nû de hatin derzî kirin. Kêvroşk piştî derzîkirina çaremîn hatin qurban kirin, û IgG-ya tevahî bi paqijkirina afînîteyê hate veqetandin. IgG ji kêvroşka herî taybetî ya EPP-ê ji bo western blotting-a din hate bikar anîn.
Ji bo western blots, MAG (n = 10, ku n jimara nimûneyên mêşên biyolojîkî serbixwe temsîl dike) û LRT ya mê (n = 30) ji nêrên bakir ên 4 rojî û mêyên bakir an jî yên bi zorê hatine hevberkirin (<10 piştî hevberkirinê), tampona derxistina proteînê (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodyûm deoksîkolat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× kokteyla astengkerê proteazê (Roche)) ji hev cuda hate zêdekirin. Nimûne piştî veqetandinê bi beader (morîkên cam ên 2 mm, 2,400 rpm, 90 saniye) yekser hatin homojenîzekirin. Bermahiyên neçareser bi santrifujkirinê di 20,000 g de li 4 °C hatin rakirin. Proteîn bi ceribandina Bradford (Bio-Rad) hatin hejmartin. Dûv re, 20 µg proteîna MAG, 40 µg proteîna LRT, û 20 µg proteîna girseyî ya mayî hatin Bi karanîna tampona MOPS bi %10 Bis-Tris NuPAGE hate denatûrîzekirin û ji hev veqetandin. Proteîn bi karanîna pergala veguhastina iBlot2 (Thermo Fisher) bo membranên polîvînîlîden florîd hatin veguhastin. Membran du caran di 1× PBS-T (%0.1 Tween-20 di PBS de) de hatin şuştin û dûv re di tampona astengkirina Odyssey (Li-Cor) de ji bo 1 saetê di 22°C de hatin astengkirin. Membran bi şev di 4°C de bi antîkorê seretayî yê polîklonal ê antî-EPP ya kergoşkê ya xwerû (1:700 di tampona astengkirinê de) û antîkorê seretayî yê monoklonal ê antî-aktîn a mişkê MAC237 (Abeam; 1:4,000) hatin hejandin. Membran bi PBS-T hatin şuştin û dûv re bi antîkorên duyemîn (antî-kergoşkê ker 800CW û antî-mişkê bizinê 680LT (Li-Cor), her du jî 1:20,000) di tampona astengkirinê de ku ji bo 0.01% SDS û 0.2% Tween-20 tê de heye hatin înkubasyonkirin. 1 saet di 22°C de. Membran bi PBS-T hatin şuştin û bi skanerek Odyssey CLx wêne hatin kişandin. Wêne di Image Studio (guhertoya 5.2) de hatin berhevkirin û pêvajo kirin. Bandek taybetî ya ku bi îzoforma EPP-RA (82 kDa) re têkildar e nehat tespîtkirin.
Herêmên kodkirinê yên EPP (wekî îzoforma AGAP002463-RB ku domaina hîstîdîn fosfatazê, lêgerîna domaina parastî ya NCBI 34 dihewîne) û EcK2 (AGAP002181) di plazmîda pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma) de hatin klonkirin; Prîmer di Tabloya Daneyên Berfireh 2 de hatine rêzkirin. Heşt girêdanên GS4 (bi hev re) berî nîşana C-termînal a 6xHis a avahiya pET-21a(+)-EcK2 hatin danîn. Proteînên rekombinant bi karanîna reaksiyona senteza proteîna E. coli ya bêhucre ya NEBExpress (New England BioLabs) hatin hilberandin. Proteînên rekombinant bi karanîna stûnên spin ên Ni yên NEBExpress (New England BioLabs) hatin paqijkirin. Proteîna kontrolê ya dîhîdrofolat redûktaz (DHFR) bi karanîna şablona DNA ji Kîta Senteza Proteîna E. coli ya Bêhucre ya NEBExpress hat hilberandin. Proteîn di nav 50% glîserol de di PBS de di -20 °C de heta 3 mehan hatin hilanîn.
Çalakiya fosfatazê ya EPP û ekstraktên tevnan bi karanîna 4-nîtrofenîl fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich) hate pîvandin. Tampona reaksiyonê 25 mM Tris, 50 mM asîda asetîk, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, û 1 mM DTT dihewîne. Tevn di tampona reaksiyonê de hate homojenîzekirin û bermahiyên şaneyê bi santrifujkirinê hatin rakirin. Reaksiyonê bi zêdekirina enzîm an ekstrakta tevnan li tampona reaksiyonê ya ku 2.5 mg ml-1 pNPP dihewîne dest pê bikin. Têkelê reaksiyonê di germahiya odeyê de di tariyê de hate înkubasyon kirin, û mîqdara pNP-ya ku ji pNPP veguherî bi pîvandina vegirtinê li 405 nm di demên cûda de hate hejmartin.
Ji bo çalakiya EcK ya in vitro, proteîn bi 0.2 mg 20E an 3D20E di nav 200 µl tamponê (pH 7.5) de ku tê de 10 mM HEPES-NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP û 10 mM MgCl2 heye, ji bo 2 saetan li 27°C hate înkubasyonkirin. Reaksiyon bi zêdekirina 800 µl metanol hate rawestandin, dûv re ji bo 1 saetê li -20°C hate sarkirin, dûv re ji bo 10 deqîqeyan li 20,000 g li 4°C hate santrifûjkirin. Dûv re supernatant bi HPLC-MS/MS hate analîzkirin. Ji bo bêçalakkirina proteînên ku di koma kontrolê de hatine bikar anîn, proteîn di nav 50% glîserolê de di PBS de ji bo 20 deqîqeyan li 95°C hatin înkubasyonkirin.
Ji bo çalakiya EPP ya in vitro, proteîn bi 3D20E22P (wekhevî mîqdara ku di 18 cotên MAG de, ku bi HPLC-MS/MS hatine paqijkirin) di 100 µl tamponê de (pH 7.5) ku tê de 25 mM Tris, 50 mM asîda asetîk, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, û 1 mM DTT hene, ji bo 3 saetan li 27°C hate înkubasyonkirin. Reaksiyon bi zêdekirina 400 µl metanol hate rawestandin û ji bo 1 saetê li -20°C hate sarkirin, dûv re ji bo 10 deqeyan li 20,000 g li 4°C hate santrifujkirin. Supernatant bi HPLC-MS/MS hate analîzkirin.
Parçeyên PCR-ê ji bo EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) û EcK2 (556 bp) ji cDNA-ya ji kadavrên mêşhingivên bêserî yên cinsên tevlihev hatî amadekirin hatin zêdekirin. Parçeya PCR-ê ya kontrola eGFP (495 bp) ji pCR2.1-eGFP-ya ku berê hatî vegotin hate zêdekirin; Prîmerên PCR di Tabloya Daneyên Berfireh 2 de hatine rêzkirin. Parçeya PCR di navbera promotorên T7 yên berevajîkirî yên li ser plazmîda pL4440 de hat danîn. Avahiyên plazmîd ji E. coli ya NEB 5-α ya jêhatî (New England Biolabs) hatin wergirtin û berî karanînê bi rêzkirina DNA-yê hatin verastkirin (ji bo rêza têxistinê li Daneyên Pêvek 1 binêre). Prîmerên ku bi promotorê T7 re hevaheng in (Tabloya Daneyên Berfireh 2) ji bo zêdekirina têxistinê ji plazmîda bingeha pL4440 hatin bikar anîn. Mezinahiya berhema PCR bi elektroforeza gel agarozê hat piştrastkirin. dsRNA ji şablonên PCR bi karanîna Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ji şablonan hat veguheztin û li gorî rêwerzên çêker bi guhertinên ku berê hatine vegotin hat paqijkirin.
Ji bo derzîkirina dsRNA, 1380 ng ji dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) bi rêjeya 10 ng nl-1 di nav sînga nêr an mêyên mezin (Nanoject III, Drummond) de di nav rojekê de piştî derxistinê hat derzîkirin. Asta kêmkirina genan di herî kêm sê dubarekirinên biyolojîkî de bi derxistina RNA, senteza cDNA, û RT-qPCR hat destnîşankirin. Ji bo derzîkirina ecdysone, mêyên bakir ên 4 rojî an bakir ên 6 rojî yên ku xwîna wan hatiye xwarin, bi rêzê ve 0.13, 0.21, an 0.63 µg ji 20E an 3D20E (Nanoject III, Drummond) bi rêjeya 1.3, 2.1, li gorî sêwirana ceribandinê, an 6.3 ng nl-1 hatin derzîkirin. 100 nl ji %10 (vol/vol) etanolê di nav avê de têxin derzîkirinê; 100 nl 3D20E22P di nav %10 etanolê de (wekhevî %75ê mîqdara ku di cotek MAGan de tê dîtin). Mêşhingiv bi awayekî rasthatî li koma derzîkirinê hatin dabeşkirin.
Ji bo ceribandinên hêkdanê, mêyên 3 rojî bi xwîna mirovan ad libitum hatin xwarin. Mêşên nîv-xwarî an jî bêxwarin hatin derxistin. Li gorî dermankirinê, mê ji bo çar şevan herî kêm 48 demjimêran piştî xwarina xwînê di qedehên hêkdanê yên cuda de hatin danîn. Hêk di bin stereoskopê de (Stemi 508, Zeiss) hatin jimartin; ji bo mêyên hevjînkirî, hêkên ku ji hêkê ve bûn larva wekî berhemdar dihatin hesibandin.
Ji bo ceribandinên hevjînkirinê, li gorî dermankirinê, ji bo ku berxwedana hevjînkirinê pêş bixin, mê herî kêm 2 roj hatin hiştin, û nêrên temen-hevcot ên celebê kovî paşê hatin xistin heman qefesê. Du şev şûnda, vezîkulên mê yên fertilîzekirî hatin parçekirin û DNAya genomîk bi cemidandin-helandin û sonîkasyonê di tamponek ku 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, û 25 mM NaCl (pH 8.2) tê de hebû, hate berdan. Nimûne bi Proteînaza K (0.86 µg µl-1) re ji bo 15 hûrdeman li 55 °C, û dûv re jî 10 hûrdeman li 95 °C hatin înkubasyonkirin. Amadekariyên DNAya genomîk a xav 10 qat hatin şilkirin û rastî tespîtkirina qPCR ya rêzikên kromozomên Y hatin; primer di Tabloya Daneyên Berfireh 2 de hatine navnîş kirin. Nebûna rêza kromozomê Y nîşan dide ku hevjînî tune ye.
Ji bo ceribandinên ji nû ve hevjînkirinê, mêyên bi zorê hevjînkirî ji bo hebûna pêvekên hevjînkirinê hatin lêkolînkirin da ku rewşa hevjînkirinê were piştrast kirin û 2 roj hiştin ku di nebûna nêran de li hember hevjînkirinê berxwedêr bibin, wekî ku berê hatiye vegotin 36. Dûv re nêrên ku sperma transgenîk a DsRed hildigirtin hatin xistin qefesên mêyan. Du şev şûnda, vezîkulên fertilîzekirinê ji mêyan hatin veqetandin, û DNAya genomîk wekî ku li jor hatiye vegotin hate amadekirin û rastî tespîtkirina qPCR ya transgena DsRed hat; primer di Tabloya Daneyên Berfireh 2 de hatine navnîş kirin. Nebûna transgena DsRed nîşan da ku ji nû ve hevjînkirin çênebûye.
3D20E wekî ku berê hatiye vegotin hate sentezkirin 37. Bi kurtasî, 10 mg ji 20E (Sigma-Aldrich) di 10 ml avê de hate çareserkirin, piştre 30 mg platîn reş (bi şiklê tozê, Sigma-Aldrich) lê hate zêdekirin. Herikek nerm a O2 bi berdewamî di nav tevliheviya reaksiyonê de hate rijandin, ku di germahiya odeyê de hate tevlihevkirin. Piştî 6 demjimêran, 30 mL metanol hate zêdekirin da ku reaksiyon were rawestandin. Tevlihev hate santrifujkirin da ku perçeyên katalîzator werin rakirin. Sermaya zêde di germahiya odeyê de di valahiyê de heta hişkbûnê hate buharkirin. Berhema reaksiyonê ya hişkkirî di nav 10% etanol û metanolê de ji bo derzîkirinê ji bo analîza HPLC-MS/MS hate çareserkirin. Rêjeya veguherînê (ji 20E ber bi 3D20E) bi qasî 97% bû (Wêne 4b), û spektruma MS ya 3D20E ya sentezkirî li gorî ya ku di mêyên hevjîn de tê dîtin (Wêne 4c) bû.
Destan hûrguliyên taybetî yên testên îstatîstîkî yên hatine kirin dihewîne. GraphPad (guhertoya 9.0) ji bo pêkanîna testa rast a Fisher, testa Mantel-Cox, û testa t ya Student hate bikar anîn. Testên Cochran-Mantel-Haenszel bi karanîna skrîptek R-ya xwerû (li https://github.com/duopeng/mantelhaen.test peyda dibe) hatin kirin. Belavkirina daneyan ji bo normalbûnê bi karanîna testa Shapiro-Wilk bi asta girîngiyê ya 0.05 hate ceribandin. Dema ku daneyên di testa normalbûnê de bi ser neketin, testa Mann-Whitney hate kirin. Daneyên saxmanan bi karanîna testa Mantel-Cox hatin analîz kirin. Pakêta DESeq2 (guhertoya 1.28.1) ji bo pêkanîna analîza îfadeya cûda ya asta gena RNA-seq hate bikar anîn. Şîşa horizontî li ser grafîkê navîn temsîl dike. Nirxek girîngiyê ya P = 0.05 wekî asta ji bo hemî testan hate bikar anîn.
Ji bo bêtir agahdarî li ser sêwirana lêkolînê, li kurtasiya Nature Research Report a ku bi vê gotarê ve girêdayî ye binêrin.
Daneyên proteomîk ên MS bi rêya PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) bi nasnameya daneya PXD032157 di Konsorsiyûma ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) de hatin hilanîn.
Seta daneya RNA-seq di Pirtûkxaneya Berfireh a Ekspresyoneke Gene (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) de di bin tomarên rêzimanî GSE198665 de hatiye hilanîn.
Li ser daxwazek maqûl, setên daneyên din ên ku di dema lêkolîna heyî de hatine çêkirin û/an analîzkirin, dikarin ji nivîskarên têkildar werin wergirtin. Ev gotar daneyên çavkaniyê peyda dike.
De Loof, A. Ecdysteroids: Steroîdên seksê yên kêzikan ên paşguhkirî? Nêr: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hîdroksîekdîzon û pêşveçûna hêkdankan di Anopheles stephens de.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).