Metabolîtên îmmunomodulator taybetmendiyek sereke ya mîkrojîngeha tumorê (TME) ne, lê ji bilî çend îstîsnayan, nasnameyên wan bi piranî nayên zanîn. Li vir, me tumor û hucreyên T ji tumor û asîtên nexweşên bi karsînoma seroz a pileya bilind (HGSC) analîz kirin da ku metaboloma van beşên cûda yên TME eşkere bikin. Asît û hucreyên tumorê cûdahiyên metabolîtên berfireh hene. Li gorî asîtê, hucreyên T yên ku tumor-dagir dikin bi girîngî di 1-metîlnîkotînamîd (MNA) de dewlemend in. Her çend asta MNA di hucreyên T de bilind be jî, îfadeya nîkotînamîd N-metîltransferazê (enzîmek ku veguhastina komên metîl ji S-adenosîlmetîonîn bo nîkotînamîd katalîze dike) bi fîbroblast û hucreyên tumorê ve sînorkirî ye. Ji hêla fonksiyonel ve, MNA hucreyên T teşwîq dike ku faktora nekroza tumorê ya sîtokîn a pêşvebirina tumorê alfa derxin. Ji ber vê yekê, MNA ya ji TME hatî wergirtin beşdarî rêkxistina parastinê ya hucreyên T dibe û armancek îmmunoterapiyê ya potansiyel ji bo dermankirina penceşêra mirovan temsîl dike.
Metabolîtên ji tumorê çêbûyî dikarin bandoreke girîng a astengker li ser parastina dijî-tumorê bikin, û bêtir û bêtir delîl nîşan didin ku ew dikarin wekî hêzek sereke ya ajotinê ji bo pêşveçûna nexweşiyê jî xizmet bikin (1). Ji bilî bandora Warburg, xebatên dawî dest pê kirine ku rewşa metabolîk a hucreyên tumorê û têkiliya wê bi rewşa parastinê ya mîkrojîngeha tumorê (TME) re diyar bikin. Lêkolînên li ser modelên mişk û hucreyên T yên mirovan nîşan dane ku metabolîzma glutamine (2), metabolîzma oksîdatîf (3) û metabolîzma glukozê (4) dikarin bi serbixwe li ser komên cûrbecûr ên hucreyên parastinê tevbigerin. Çend metabolîtên di van rêyan de fonksiyona dijî-tumor a hucreyên T asteng dikin. Hatiye îspatkirin ku astengkirina koenzîma tetrahydrobiopterin (BH4) dikare zirarê bide zêdebûna hucreyên T, û zêdebûna BH4 di laş de dikare bersiva parastinê ya dijî-tumorê ya ku ji hêla CD4 û CD8 ve tê navbeynkar kirin zêde bike. Wekî din, bandora îmmunosupresîf a kynurenine dikare bi rêveberiya BH4 were rizgarkirin (5). Di glioblastoma mutant a îzosîtrate dehydrogenase (IDH) de, derdana enantiometabolîk (R)-2-hîdroksîglûtarat (R-2-HG) çalakbûn, zêdebûn û çalakiya sîtolîzê ya hucreya T asteng dike (6). Di demên dawî de, hatiye nîşandan ku methylglyoxal, berhemeke glîkolîzê, ji hêla hucreyên tepeserker ên bi eslê xwe mîeloîd ve tê hilberandin, û veguhastina methylglyoxal a hucreya T dikare fonksiyona hucreya T ya bandorker asteng bike. Di dermankirinê de, bêbandorkirina methylglyoxal dikare çalakiya hucreyên tepeserker ên ji mîeloîd (MDSC) derbas bike û bi awayekî sinerjîk terapiya astengkirina xalên kontrolê di modelên mişkan de zêde bike (7). Ev lêkolîn bi hev re rola sereke ya metabolîtên ji TME-yê hatine wergirtin di rêkxistina fonksiyon û çalakiya hucreya T de tekez dikin.
Nelirêtiya hucreya T di kansera hêkdankê de bi berfirehî hatiye ragihandin (8). Ev qismî ji ber taybetmendiyên metabolîk ên xwerû di hîpoksî û damarên tumor ên neasayî de ye (9), ku dibe sedema veguherîna glukoz û trîptofanê bo berhemên alîgir ên wekî asîda laktîk û kynurenine. Laktata zêde ya derveyî hucreyê hilberîna interferon-γ (IFN-γ) kêm dike û cûdakirina binkomên mîelosupresîf dimeşîne (10, 11). Xerckirina trîptofanê rasterast zêdebûna hucreya T asteng dike û sînyala reseptora hucreya T asteng dike (12-14). Tevî van çavdêriyan, gelek xebat li dora metabolîzma parastinê di çanda hucreya T ya in vitro de bi karanîna medyaya çêtirînkirî, an jî bi modelên homolog ên mişk ên in vivo ve sînorkirî hate kirin, ku yek ji wan bi tevahî nehevsengiya kanserên mirovan û jîngeha makro û mîkro ya fîzyolojîk nîşan nade.
Taybetmendiyeke hevpar a kansera hêkdankê belavbûna perîtonê û xuya bûna asîtê ye. Kombûna şileya hucreyê di asîtê de bi nexweşiya pêşketî û pêşbîniya xirab ve girêdayî ye (15). Li gorî raporan, ev beşa bêhempa hîpoksîk e, asta wê ya bilind a faktora mezinbûna endoteliya damarî (VEGF) û îndolamîn 2,3-dîoksîjenaz (IDO) heye, û ji hêla hucreyên rêkûpêk ên T û hucreyên astengker ên mîyeloîd ve tê dagirkirin (15-18). Jîngeha metabolîk a asîtê dibe ku ji ya tumorê bi xwe cuda be, ji ber vê yekê ji nû ve bernamekirina hucreyên T di qada perîtonê de ne diyar e. Wekî din, cûdahiyên sereke û nehevsengiya di navbera asîtê û metabolîtên ku di jîngeha tumorê de hene dibe ku astengiya dagirkirina hucreyên parastinê û fonksiyona wan li ser tumoran bike, û lêkolînên bêtir hewce ne.
Ji bo çareserkirina van pirsgirêkan, me rêbazek veqetandina hucreyên hesas û kromatografiya şile ya spektrometriya girseyî ya tandem (LC-MS/MS) sêwirand da ku celebên hucreyên cûda (di nav de hucreyên T yên CD4 + û CD8 +) û her weha di nav tumor û di navbera wan de lêkolîn bikin. Metabolîtên wê hucreyên di heman asît û hawîrdora tumorê ya nexweş de vedihewînin. Em vê rêbazê bi hev re bi sîtometriya herikîna bilind-alî û rêzkirina RNA ya yek-hucreyî (scRNA-seq) bikar tînin da ku portreyek pir çareserkirî ya rewşa metabolîk a van nifûsên sereke peyda bikin. Vê rêbazê zêdebûnek girîng di asta 1-metîlnîkotînamîd (MNA) de di hucreyên T yên tumorê de eşkere kir, û ceribandinên in vitro nîşan dan ku bandora îmmunomodulator a MNA li ser fonksiyona hucreya T berê nenas bû. Bi gelemperî, ev rêbaz têkiliyên metabolîk ên hevbeş di navbera tumor û hucreyên parastinê de eşkere dike, û têgihiştinên bêhempa li ser metabolîtên rêziknameya parastinê peyda dike, ku dibe ku ji bo dermankirina îmmunoterapiya kansera hêkdankê ya li ser bingeha hucreya T bikêr be. Derfetên Dermankirinê.
Me sîtometrîya herikîna bilind-alî bikar anî da ku di heman demê de kişandina glukozê [2-(N-(7-nîtrofenîl-2-oksa-1,3-dîaza-4-îl)amîno)-2-deoksîglûkoz (2-NBDG) û çalakiya mîtokondrî [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) nîşankerên tîpîk ên li kêleka hev in ku hucreyên parastinê û nifûsa hucreyên tumorê ji hev cuda dikin (Tabloya S2 û Wêneya S1A). Vê analîzê nîşan da ku li gorî hucreyên T, asît û hucreyên tumorê astên kişandina glukozê yên bilindtir hene, lê di çalakiya mîtokondrî de cûdahiyên piçûktir hene. Girtina navînî ya glukozê ya hucreyên tumorê [CD45-EpCAM (EpCAM)+] sê heta çar caran ji hucreyên T ye, û kişandina navînî ya glukozê ya hucreyên CD4+ T 1,2 caran ji hucreyên CD8+ T ye, ku nîşan dide ku lîmfosîtên înfîltratîv ên tumorê (TIL) hewcedariyên metabolîk ên cûda hene, tewra di heman TME de jî (Wêneya 1A). Berevajî vê, çalakiya mîtokondrî di hucreyên tumorê de dişibihe ya hucreyên CD4 + T, û çalakiya mîtokondrî ya her du celebên hucreyan ji ya hucreyên CD8 + T bilindtir e (Wêne 1B). Bi gelemperî, ev encam asta metabolîk nîşan didin. Çalakiya metabolîk a hucreyên tumorê ji ya hucreyên CD4 + T bilindtir e, û çalakiya metabolîk a hucreyên CD4 + T ji ya hucreyên CD8 + T bilindtir e. Tevî van bandorên li seranserê celebên hucreyan, di rewşa metabolîk a hucreyên CD4 + û CD8 + T an jî rêjeyên wan ên nisbî di asîtan de li gorî tumoran de cûdahiyek domdar tune (Wêne 1C). Berevajî vê, di fraksiyona hucreyên CD45-ê de, rêjeya hucreyên EpCAM+ di tumorê de li gorî asîtan zêde bû (Wêne 1D). Me her weha cûdahiyek metabolîk a zelal di navbera pêkhateyên hucreyên EpCAM+ û EpCAM- de dît. Hucreyên EpCAM+ (tumor) xwedî wergirtina glukozê û çalakiya mîtokondrî ji hucreyên EpCAM- bilindtir in, ku ji çalakiya metabolîk a fîbroblastan di hucreyên tumorê de di TME de pir bilindtir e (Wêne 1, E û F).
(A û B) Şîddeta navîn a fluoresansa (MFI) ya wergirtina glukozê (2-NBDG) (A) û çalakiya mîtokondrî ya hucreyên CD4 + T (sorê tarî yê MitoTracker) (B) Grafikên nûner (çep) û daneyên tablokirî (Rast), hucreyên CD8 + T û hucreyên tumorê EpCAM + CD45 ji asîtan û tumorê. (C) Rêjeya hucreyên CD4 + û CD8 + (ji hucreyên CD3 + T) di asîtan û tumorê de. (D) Rêjeya hucreyên tumorê EpCAM + di asîtan û tumorê de (CD45−). (E û F) Wergirtina glukozê ya EpCAM + CD45 û matrîksa EpCAM-CD45 (2-NBDG) (E) û çalakiya mîtokondrî (sorê tarî yê MitoTracker) (F) grafikên nûner (çep) û daneyên tablokirî (Rast) Asît û hucreyên tumorê. (G) Grafikên nûner ên îfadeya CD25, CD137 û PD1 bi sîtometrîya herikînê. (H û I) Derbirîna CD25, CD137 û PD1 li ser hucreyên CD4 + T (H) û hucreyên CD8 + T (I). (J û K) Fenotipên bîra navendî (Tcm), bandorker (Teff) û bîra bandorker (Tem) li ser bingeha derbirîna CCR7 û CD45RO. Wêneyên nûner (çep) û daneyên tabular (rast) ên hucreyên CD4 + T (J) û hucreyên CD8 + T (K) di asîtan û tumoran de. Nirxên P ​​bi testa t-ya cotkirî hatine destnîşankirin (*P<0.05, **P<0.01 û ***P<0.001). Xet nexweşên hevberkirî temsîl dike (n = 6). FMO, fluoresansa kêm yek; MFI, şîdeta fluoresansa navîn.
Analîzên din cudahîyên girîng ên din di navbera rewşa fenotipîk a hucreya T ya pir çareserkirî de eşkere kirin. Bîra çalakkirî (Wêne 1, G heta I) û bandorker (Wêne 1, J û K) di tumoran de ji asîtan (rêjeya hucreyên CD3 + T) pirtir in. Bi heman awayî, analîzkirina fenotipê bi îfadeya nîşankerên çalakkirinê (CD25 û CD137) û nîşankerên kêmbûnê [proteîna mirina hucreya bernamekirî 1 (PD1)] nîşan da ku her çend taybetmendiyên metabolîk ên van nifûsan cûda bin (Wêne S1, B heta E), lê di navbera binkomên saf, bandorker an bîranînê de tu cudahîyên metabolîk ên girîng bi domdarî nehatin dîtin (Wêne S1, F heta I). ​​Ev encam bi karanîna rêbazên fêrbûna makîneyê ji bo destnîşankirina otomatîkî ya fenotipên hucreyan hatin piştrast kirin (21), ku hebûna hejmareke mezin ji hucreyên mêjiyê hestî (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) di asîta nexweş de eşkere kir (Wêne S2A). Di nav hemû celebên şaneyên ku hatine destnîşankirin de, ev nifûsa şaneyên mîyeloîd xwedîkirina glukozê û çalakiya mîtokondrî ya herî bilind nîşan da (Wêne S2, B heta G). Ev encam cûdahiyên metabolîk ên bihêz di navbera celebên pirjimar ên şaneyan de ku di asît û tumorên nexweşên HGSC de têne dîtin, ronî dikin.
Di têgihîştina taybetmendiyên metabolomîk ên TIL de, zehmetiya sereke ew e ku nimûneyên hucreyên T yên bi paqijî, kalîte û mîqdara têr ji tumoran werin veqetandin. Lêkolînên dawî nîşan dane ku rêbazên rêzkirin û dewlemendkirina mûyan ên li ser bingeha sîtometriya herikînê dikarin bibin sedema guhertinên di profîlên metabolîtên hucreyî de (22-24). Ji bo derbaskirina vê pirsgirêkê, me rêbaza dewlemendkirina mûyan çêtir kir da ku TIL ji kansera hêkdankê ya mirovan a bi emeliyatê hatiye jêkirin berî analîzkirina bi LC-MS/MS veqetînin û îzole bikin (li Materyal û Rêbazan binêre; Wêne 2A). Ji bo nirxandina bandora giştî ya vê protokolê li ser guhertinên metabolîtan, me profîlên metabolîtên hucreyên T yên ku ji hêla donorên saxlem ve piştî gava veqetandina mûyan a jorîn hatine aktîfkirin bi hucreyên ku bi mûyan nehatine veqetandin lê li ser qeşayê mane re berhev kirin. Vê analîza kontrola kalîteyê dît ku di navbera van her du mercan de têkiliyek bilind heye (r = 0.77), û dubarebûna teknîkî ya koma 86 metabolîtan xwedî dubarebûnek bilind e (Wêne 2B). Ji ber vê yekê, ev rêbaz dikarin analîza metabolîtên rast di hucreyên ku dewlemendkirina celebê hucreyê derbas dikin de pêk bînin, bi vî rengî platforma yekem a çareseriya bilind ji bo destnîşankirina metabolîtên taybetî di HGSC de peyda dikin, bi vî rengî mirov dikarin têgihîştinek kûrtir a bernameya metabolîzma cinsî ya taybetmendiya hucreyê bi dest bixin.
(A) Diyagrama şematîk a dewlemendkirina mûyên magnetîkî. Berî analîzkirina bi LC-MS/MS, hucre dê sê dorên li pey hev ên dewlemendkirina mûyên magnetîkî derbas bikin an jî li ser qeşayê bimînin. (B) Bandora celebê dewlemendkirinê li ser pirbûna metabolîtan. Navînîya sê pîvandinan ji bo her celebê dewlemendkirinê ± SE. Xeta gewr têkiliyek 1:1 temsîl dike. Korrelasyona nav-polê (ICC) ya pîvandinên dubarekirî yên ku di etîketa eksê de têne nîşandan. NAD, nîkotînamîd adenîn dînukleotîd. (C) Diyagrama şematîk a herikîna karê ya analîza metabolîta nexweşan. Asît an tumor ji nexweşan têne berhevkirin û têne krîyoparastin. Beşek piçûk ji her nimûneyê bi sîtometrîya herikînê hate analîzkirin, di heman demê de nimûneyên mayî sê dorên dewlemendkirinê ji bo hucreyên CD4+, CD8+ û CD45- derbas kirin. Ev fraksiyonên hucreyan bi karanîna LC-MS/MS hatin analîzkirin. (D) Nexşeya germê ya pirbûna metabolîta standardîzekirî. Dendrogram komkirina dûrbûnên Euclidean ên Ward di navbera nimûneyan de temsîl dike. (E) Analîza pêkhateya sereke (PCA) ya nexşeya metabolîta nimûneyê, sê dubarekirinên her nimûneyê nîşan dide, nimûneyên ji heman nexweş bi xêzekê ve girêdayî ne. (F) PCA ya profîla metabolîta nimûneyê ya li ser nexweş şertkirî (ango, bi karanîna dubarebûna qismî); celebê nimûneyê bi qalikê konveks ve sînorkirî ye. PC1, pêkhateya sereke 1; PC2, pêkhateya sereke 2.
Piştre, me ev rêbaza dewlemendkirinê bikar anî da ku 99 metabolîtên di fraksiyonên hucreyên CD4+, CD8+ û CD45-ê de di asîtên seretayî û tumorên şeş nexweşên HGSC de analîz bikin (Wêne 2C, Wêne S3A û Tabloya S3 û S4). Nifûsa balkêş ji %2 heta %70-ê nimûneya mezin a hucreyên zindî ya orîjînal pêk tîne, û rêjeya hucreyan di navbera nexweşan de pir diguhere. Piştî veqetandina mûyan, fraksiyona dewlemendkirî ya balkêş (CD4+, CD8+ an CD45-) bi navînî ji %85-ê zêdetir ji hemî hucreyên zindî yên di nimûneyê de pêk tîne. Ev rêbaza dewlemendkirinê dihêle ku em nifûsa hucreyan ji metabolîzma şaneyên tumorê yên mirovan analîz bikin, ku ev yek ji nimûneyên mezin ne gengaz e. Bi karanîna vê protokolê, me diyar kir ku l-kynurenine û adenosine, ev du metabolîtên îmmunosupresîf ên baş-taybetmendî di hucreyên T yên tumor an hucreyên tumor de bilind bûne (Wêne S3, B û C). Ji ber vê yekê, ev encam dilsozî û şiyana teknolojiya veqetandina hucreyan û spektrometriya girseyî ya me nîşan didin ku metabolîtên girîng ên biyolojîkî di şaneyên nexweşan de bibîne.
Analîza me her wiha cudabûnek metabolîk a bihêz a celebên hucreyan di nav nexweşan de û di navbera wan de eşkere kir (Wêne 2D û Wêne S4A). Bi taybetî, li gorî nexweşên din, nexweşê 70 taybetmendiyên metabolîk ên cûda nîşan da (Wêne 2E û Wêne S4B), ku nîşan dide ku dibe ku di navbera nexweşan de nehevsengiyek metabolîk a girîng hebe. Hêjayî gotinê ye ku li gorî nexweşên din (1.2 heta 2 lître; Tabloya S1), tevahî mîqdara asîtên ku di nexweşê 70 de hatine berhevkirin (80 ml) piçûktir bû. Kontrola nehevsengiya navbera nexweşan de di dema analîza pêkhateya sereke de (mînakî, bi karanîna analîza dubarebûna qismî) guhertinên domdar di navbera celebên hucreyan de nîşan dide, û celebên hucreyan û/an jîngeha mîkro bi zelalî li gorî profîla metabolîtan têne berhev kirin (Wêne 2F). Analîza metabolîtên yekane van bandoran tekez kir û cûdahiyên girîng di navbera celebên hucreyan û jîngeha mîkro de eşkere kir. Hêjayî gotinê ye ku cûdahiya herî tund a ku tê dîtin MNA ye, ku bi gelemperî di hucreyên CD45- û di hucreyên CD4+ û CD8+ de dewlemend e ku di nav tumorê de diherikin (Wêne 3A). Ji bo şaneyên CD4+, ev bandor herî eşkere ye, û xuya ye ku MNA di şaneyên CD8+ de jî ji hêla jîngehê ve bi tundî bandor dibe. Lêbelê, ev ne girîng e, ji ber ku tenê sê ji şeş nexweşan dikarin ji bo puanên CD8+ yên tumorê werin nirxandin. Ji bilî MNA, di celebên cûda yên şaneyan de di asît û tumoran de, metabolîtên din ên ku di TIL de bi rengekî xirab têne destnîşankirin jî bi awayekî cûda dewlemend in (Wêneyên S3 û S4). Ji ber vê yekê, ev dane komek metabolîtên îmmunomodulator ên sozdar ji bo lêkolînên bêtir eşkere dikin.
(A) Naveroka normalîzekirî ya MNA di hucreyên CD4+, CD8+ û CD45- de ji asîtan û tumorê. Nexşeya qutiyê navîn (xet), rêza navbera çarçikan (çembera çarçoveyê) û rêza daneyan nîşan dide, heta 1.5 carî rêza navbera çarçikan (çirpika çarçoveyê). Wekî ku di Materyal û Rêbazên Nexweşan de hatî vegotin, nirxa lîmaya nexweş bikar bînin da ku nirxa P diyar bikin (*P<0.05 û **P<0.01). (B) Diyagrama şematîk a metabolîzma MNA (60). Metabolît: S-adenosîl-1-metîyonîn; SAH, S-adenosîn-1-homosîsteîn; NA, nîkotînamîd; MNA, 1-metîlnîkotînamîd; 2-PY, 1-metîl-2-pîrîdon-5-karboksamîd; 4-PY, 1-metîl-4-pîrîdon-5-karboksamîd; NR, nîkotînamîd rîboz; NMN, nîkotînamîd mononukleotîd. Enzîm (kesk): NNMT, nîkotînamîd N-metîltransferaz; SIRT, sirtuîn; NAMPT, nîkotînamîd fosforîbozîl transferaz; AOX1, aldehîd oksîdaz 1; NRK, nîkotînamîd rîbozîd kînaz; NMNAT, nîkotînamîd mono Nukleotîd adenîlat transferaz; Pnp1, purîn nukleozîd fosforîlaz. (C) t-SNE ya scRNA-seq a asîtan (gewr) û tumor (sor; n = 3 nexweş). (D) Derbirîna NNMT di nifûsên şaneyên cûda de ku bi karanîna scRNA-seq hatine destnîşankirin. (E) Derbirîna NNMT û AOX1 di SK-OV-3, gurçika embrîyonîk a mirovî (HEK) 293T, şaneyên T û şaneyên T yên bi MNA hatine dermankirin de. Derbirîna qatkirî li gorî SK-OV-3 tê nîşandan. Şêweya derbirînê bi SEM tê nîşandan (n = 6 donorên saxlem). Nirxên Ct yên ji 35 mezintir wekî nehatine tespîtkirin (UD) têne hesibandin. (F) Derbirîna SLC22A1 û SLC22A2 di hucreyên SK-OV-3, HEK293T, T û hucreyên T yên ku bi 8mM MNA hatine dermankirin de. Derbirîna qatkirî li gorî SK-OV-3 tê nîşandan. Qaliba derbirînê bi SEM tê nîşandan (n = 6 donorên saxlem). Nirxên Ct yên ji 35 mezintir wekî nayên tespîtkirin têne hesibandin (UD). (G) Naveroka MNA ya hucreyê di hucreyên T yên donorên saxlem ên aktîfkirî de piştî 72 demjimêran înkubasyonê bi MNA re. Qaliba derbirînê bi SEM tê nîşandan (n = 4 donorên saxlem).
MNA bi veguhestina koma metîl ji S-adenosyl-1-methionine (SAM) bo nîkotînamîdê (NA) ji hêla nîkotînamîd N-methyltransferazê (NNMT; Wêne 3B) ve tê hilberandin. NNMT di cûrbecûr penceşêrên mirovan de zêde tê îfadekirin û bi zêdebûn, dagirkirin û metastazê ve girêdayî ye (25-27). Ji bo ku em çavkaniya MNA di hucreyên T de di TME de çêtir fam bikin, me scRNA-seq bikar anî da ku îfadeya NNMT li seranserê celebên hucreyan di asîte û tumorên sê nexweşên HGSC de diyar bikin (Tabloya S5). Analîza nêzîkî 6,500 hucreyan nîşan da ku di hawîrdorên asîte û tumorê de, îfadeya NNMT bi nifûsa hucreyên fîbroblast û tumorê yên texmînkirî ve sînordar bû (Wêne 3, C û D). Hêjayî gotinê ye ku di tu nifûsê de ku PTPRC (CD45 +) îfade dike, îfadeya NNMT ya eşkere tune ye (Wêne 3D û Wêne S5A), ku nîşan dide ku MNA ya ku di spektruma metabolîtê de hatî tespîtkirin ketiye nav hucreyên T. Derbirîna aldehîd oksîdaz 1 (AOX1) MNA vediguherîne 1-metîl-2-pîrîdon-5-karboksamîd (2-PYR) an 1-metîl-4-pîrîdon-5-karboksamîd (4-PYR); Wêne 3B) her wiha bi nifûsa fîbroblastên ku COL1A1 derdixin ve sînordar e (Wêne S5A), ku bi hev re nîşan didin ku hucreyên T ne xwediyê şiyana metabolîzma MNA ya kevneşopî ne. Şêweya derbirîna van genên têkildarî MNA bi karanîna komek daneyên hucreya serbixwe ya duyemîn ji asîtên ji nexweşên HGSC hate verast kirin (Wêne S5B; n = 6) (16). Wekî din, analîza reaksiyona zincîra polîmerazê ya hejmarî (qPCR) ya hucreyên T yên donor ên saxlem ên ku bi MNA hatine dermankirin nîşan da ku li gorî hucreyên tumora hêkdankê yên kontrolê SK-OV-3, NNMT an AOX1 hema hema nehatine derbirîn (Wêne 3E). Ev encamên nediyar nîşan didin ku MNA dibe ku di TME de ji fîbroblast an tumoran ber bi hucreyên T yên cîran ve were veşartin.
Her çend namzed malbata veguhezkarên katyonên organîk 1 heta 3 (OCT1, OCT2 û OCT3) yên ku ji hêla malbata hilgirê çareserker 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 û SLC22A3) ve kodkirî ne jî di nav xwe de digirin, veguhezkarên potansiyel ên MNA hîn jî nayên destnîşankirin (28). QPCR ya mRNA ji hucreyên T yên donor ên saxlem astên îfadeya kêm a SLC22A1 lê astên neteqandî yên SLC22A2 nîşan da, ku piştrast kir ku ew berê di wêjeyê de hatibû ragihandin (Wêne 3F) (29). Berevajî vê, xeta hucreya tumora hêkdankê ya SK-OV-3 astên bilind ên her du veguhezkaran nîşan da (Wêne 3F).
Ji bo ceribandina îhtîmala hebûna hucreyên T ji bo kişandina MNA ya biyanî, hucreyên T yên donor ên saxlem 72 saetan di hebûna konsantrasyonên cûda yên MNA de hatin çandin. Di nebûna MNA ya eksojen de, naveroka hucreyî ya MNA nayê tespîtkirin (Wêne 3G). Lêbelê, hucreyên T yên aktîvkirî yên ku bi MNA ya eksojen hatine dermankirin, zêdebûnek doz-girêdayî di naveroka MNA ya di hucreyan de nîşan dan, heta 6 mM MNA (Wêne 3G). Ev encam nîşan dide ku tevî asta nizm a îfadeya veguhezkar û nebûna enzîma sereke ya berpirsiyarê metabolîzma MNA ya nav hucreyî, TIL hîn jî dikare MNA bigire.
Spektora metabolîtan di hucreyên T yên nexweşan de û ceribandinên vegirtina MNA yên di vitro de îhtîmala ku fîbroblastên bi penceşêrê ve girêdayî (CAF) MNA derxin û hucreyên tumor dikarin fenotip û fonksiyona TIL rêk bixin zêde dike. Ji bo destnîşankirina bandora MNA li ser hucreyên T, hucreyên T yên donor ên saxlem di vitro de di hebûn an nebûna MNA de hatin çalak kirin, û pirbûn û hilberîna wan a sîtokîn hatin nirxandin. Piştî 7 rojan ji zêdekirina MNA bi doza herî bilind, hejmara duqatkirina nifûsê bi nermî kêm bû, di heman demê de zindîtî di hemî dozan de hate domandin (Wêne 4A). Wekî din, dermankirina MNA ya eksojen bû sedema zêdebûna rêjeya hucreyên T yên CD4 + û CD8 + yên ku faktora nekroza tumor-α (TNFα; Wêne 4B) îfade dikin. Berevajî vê, hilberîna navxaneyî ya IFN-γ di hucreyên T yên CD4 + de bi girîngî kêm bû, lê di hucreyên T yên CD8 + de ne, û di interleukin 2 (IL-2; Wêne 4, C û D) de guherînek girîng tune bû. Ji ber vê yekê, ceribandina îmmunosorbent a girêdayî enzîmê (ELISA) ya supernatantên ji van çandên hucreyên T yên bi MNA hatine dermankirin zêdebûnek girîng di TNFα, kêmbûnek di IFN-γ, û ti guhertinek di IL-2 de nîşan da (Wêne 4, E heta G). . Kêmkirina IFN-γ nîşan dide ku MNA dibe ku rolek di astengkirina çalakiya dij-tumor a hucreyên T de bilîze. Ji bo simulasyona bandora MNA li ser sîtotoksîsîteya bi navgîniya hucreya T, hucreyên reseptora antîjena kîmerîk T (FRα-CAR-T) yên ku reseptora folat α û hucreyên CAR-T (GFP) yên ku ji hêla proteîna floresan a kesk (GFP) ve têne rêvebirin hedef digirin - hucreyên CAR-T) ji hêla hucreyên mononukleer ên xwîna periferîk ên donorên saxlem (PBMC) ve têne hilberandin. Hucreyên CAR-T ji bo 24 demjimêran di hebûna MNA de hatin çandin, û dûv re bi hucreyên tumorê ovarian ên SK-OV-3 yên mirovî yên ku reseptora folat α bi rêjeya bandorker berbi hedefê ya 10:1 vedibêjin re hatin hev-çandin. Dermankirina MNA bû sedema kêmbûnek girîng di çalakiya kuştina hucreyên FRα-CAR-T de, ku dişibiya hucreyên FRα-CAR-T yên ku bi adenosine hatine dermankirin (Wêne 4H).
(A) Jimara giştî ya şaneyên zindî û duqatkirina nifûsê (PD) rasterast ji kulturê di roja 7an de. Grafîka bar navînî + SEM ya şeş bexşvanên saxlem temsîl dike. Daneyên ji herî kêm n = 3 ceribandinên serbixwe temsîl dike. (B heta D) CD3/CD28 û IL-2 ji bo çalakkirina şaneyên T di konsantrasyonên MNA yên wan ên têkildar de ji bo 7 rojan hatin bikar anîn. Berî analîzê, şaneyên bi PMA/ionomycin bi GolgiStop ji bo 4 saetan hatin teşwîqkirin. Îfadeya TNFα (B) di şaneyên T de. Wêneya nimûne (çep) û daneyên tabular (rast) yên îfadeya TNFα di şaneyên zindî de. Îfadeya IFN-γ (C) û IL-2 (D) di şaneyên T de. Îfadeya sîtokînan bi sîtometrîya herikînê hate pîvandin. Grafîka bar navînî (n = 6 bexşvanên saxlem) + SEM temsîl dike. Analîza yekalî ya guherînê û pîvanên dubarekirî (*P<0.05 û **P<0.01) bikar bînin da ku nirxa P diyar bikin. Daneyên ji herî kêm n = 3 ceribandinên serbixwe temsîl dike. (E heta G) CD3/CD28 û IL-2 ji bo çalakkirina hucreyên T di konsantrasyonên wan ên MNA de ji bo 7 rojan hatin bikar anîn. Navgîn berî û piştî 4 demjimêran ji teşwîqkirina PMA/îyonomîsînê hate berhevkirin. Konsantrasyonên TNFα (E), IFN-γ (F) û IL-2 (G) bi ELISA hatin pîvandin. Grafîka bar navînî (n = 5 donorên saxlem) + SEM temsîl dike. Nirxa P bi karanîna analîza yekalî ya guherbariyê û pîvandinên dubarekirî hate destnîşankirin (*P<0.05). Xeta xalxalî sînorê tespîtkirina tespîtkirinê nîşan dide. (H) Ceribandina lîza hucreyê. Hucreyên FRα-CAR-T an GFP-CAR-T bi adenozîn (250μM) an MNA (10 mM) ji bo 24 demjimêran hatin sererast kirin, an jî bê dermankirin hatin hiştin (Ctrl). Rêjeya kuştina hucreyên SK-OV-3 hate pîvandin. Nirxa P bi testa t ya Welch hate destnîşankirin (*P<0.5 û **P<0.01).
Ji bo ku têgihîştineke mekanîstîk a rêkxistina îfadeya TNFα ya girêdayî MNA were bidestxistin, guhertinên di mRNA ya TNFα ya hucreyên T yên bi MNA hatine dermankirin de hatin nirxandin (Wêne 5A). Hucreyên T yên donor ên saxlem ên ku bi MNA hatine dermankirin, du qat zêdebûnek di asta transkrîpsiyona TNFα de nîşan dan, ku nîşan dide ku MNA bi rêkxistina transkrîpsiyona TNFα ve girêdayî ye. Ji bo lêkolîna vê mekanîzmaya rêkxistina gengaz, du faktorên transkrîpsiyonê yên naskirî yên ku TNFα rêk dixin, ango faktora navokî ya hucreya T ya çalakkirî (NFAT) û proteîna taybetî 1 (Sp1), di bersiva girêdana MNA de bi promotorê TNFα ya nêzîk hatin nirxandin (30). Promotorê TNFα 6 cihên girêdana NFAT yên naskirî û 2 cihên girêdana Sp1 dihewîne, ku li yek cihî hevûdu digirin [-55 cotên bingehîn (bp) ji 5'cap] (30). Îmûnpresîpîtasyona kromatînê (ChIP) nîşan da ku dema ku bi MNA tê dermankirin, girêdana Sp1 bi promotorê TNFα sê qat zêde dibe. Têkelkirina NFAT jî zêde bû û gihîşt girîngiyê (Wêne 5B). Ev dane nîşan didin ku MNA îfadeya TNFα bi rêya transkrîpsiyona Sp1, û di rêjeyek kêmtir de îfadeya NFAT rêk dixe.
(A) Li gorî hucreyên T yên bê MNA hatine çandin, guherîna qat a îfadeya TNFα di hucreyên T yên bi MNA hatine dermankirin de. Şêweya îfadeyê bi SEM tê nîşandan (n = 5 donorên saxlem). Daneyên ji herî kêm n = 3 ceribandinên serbixwe temsîl dike. (B) Promotera TNFα ya hucreyên T yên bi 8 mM MNA an bêyî wê hatine dermankirin piştî ku NFAT û Sp1 bi (Ctrl) û teşwîqa PMA/ionomycin ji bo 4 demjimêran hatin hev kirin. Îmûnoglobulin G (IgG) û H3 wekî kontrolên neyînî û erênî ji bo îmûnoprecipitasyonê, bi rêzê ve, hatin bikar anîn. Pîvandina ChIP nîşan da ku girêdana Sp1 û NFAT bi promotera TNFα di hucreyên ku bi MNA hatine dermankirin de li gorî kontrolê çend caran zêde bûye. Daneyên ji herî kêm n = 3 ceribandinên serbixwe temsîl dike. Nirxa P bi gelek testên t-yê ve hatî destnîşankirin (*** P <0.01). (C) Li gorî asîtên HGSC, hucreyên T (ne-sîtotoksîk) îfadeya TNF di tumorê de zêde nîşan dan. Reng nexweşên cûda temsîl dikin. Xaneyên nîşandayî bi awayekî rasthatî heta 300 hatine nimûnekirin û ji bo sînordarkirina zêdebûnê hatine hejandin (** Padj = 0.0076). (D) Modela pêşniyarkirî ya MNA ji bo kansera hêkdankê. MNA di xaneyên tumor û fîbroblastan de di TME de tê hilberandin û ji hêla xaneyên T ve tê girtin. MNA girêdana Sp1 bi pêşvebirê TNFα zêde dike, ku dibe sedema zêdebûna transkrîpsiyona TNFα û hilberîna sîtokîna TNFα. MNA di heman demê de dibe sedema kêmbûna IFN-γ. Astengkirina fonksiyona xaneya T dibe sedema kêmbûna şiyana kuştinê û bilezbûna mezinbûna tumor.
Li gorî raporan, TNFα bandorên dij-tûmor û dij-tûmor ên girêdayî pêş û paş hene, lê roleke wê ya baş-zanîn di pêşvebirina mezinbûn û metastaza kansera hêkdankê de heye (31-33). Li gorî raporan, rêjeya TNFα di asîte û tevnên tumorê yên nexweşên bi kansera hêkdankê de ji ya di tevnên benîgn de bilindtir e (34-36). Ji hêla mekanîzmayê ve, TNFα dikare çalakkirin, fonksiyon û zêdebûna xirokên spî yên xwînê rêk bixe, û fenotipa xirokên kanserê biguherîne (37, 38). Li gorî van dîtinan, analîza îfadeya genê ya cûda nîşan da ku TNF di xirokên T de di tevnên tumorê de li gorî asîtê bi girîngî zêde bûye (Wêne 5C). Zêdebûna îfadeya TNF tenê di nifûsa xirokên T de bi fenotipek ne-sîtotoksîk eşkere bû (Wêne S5A). Bi kurtasî, ev dane piştgirî didin wê nêrînê ku MNA di HGSC de bandorên dualî yên îmmunosupresîf û pêşvebirina tumorê hene.
Etîketkirina floresan a li ser bingeha sîtometriya herikînê bûye rêbaza sereke ji bo lêkolîna metabolîzma TIL. Van lêkolînan nîşan dane ku li gorî lîmfosîtên xwîna periferîk an hucreyên T ji organên lîmfoîd ên duyemîn, TIL-ên mişk û mirovan xwedî meyla wergirtina glukozê ne (4, 39) û windakirina gav bi gav a fonksiyona mîtokondrî ne (19, 40). Her çend me di vê lêkolînê de encamên wekhev dîtine jî, pêşkeftina sereke ew e ku metabolîzma hucreyên tumor û TIL ji heman tevna tumorê ya jêkirî were berhev kirin. Li gorî hin ji van raporên berê, hucreyên tumor (CD45-EpCAM +) ji asîtan û tumoran wergirtina glukozê ji hucreyên T CD8 + û CD4 + bilindtir in, ku piştgirî dide ku wergirtina glukozê ya bilind a hucreyên tumor dikare bi hucreyên T re were berhev kirin. Têgeha pêşbaziya hucreya T. TME. Lêbelê, çalakiya mîtokondrî ya hucreyên tumor ji ya hucreyên T CD8 + bilindtir e, lê çalakiya mîtokondrî dişibihe ya hucreyên T CD4 +. Ev encam mijara derketî xurt dikin ku metabolîzma oksîdatîf ji bo hucreyên tumor girîng e (41, 42). Ew her wiha pêşniyar dikin ku hucreyên CD8+ T dibe ku ji hucreyên CD4+ T bêtir hesas bin ji bo bêserûberiya oksîdatîf, an jî hucreyên CD4+ T dikarin çavkaniyên karbonê yên ji bilî glukozê bikar bînin da ku çalakiya mîtokondrî biparêzin (43, 44). Divê were zanîn ku me di navbera bandorkerên CD4+ T, bîra bandorkerên T û hucreyên bîra navendî yên T de di asîtê de ti cûdahiyek di kişandina glukozê an çalakiya mîtokondrî de nedît. Bi heman awayî, rewşa cûdakirina hucreyên CD8+ T di tumoran de ti eleqeya wê bi guhertinên di kişandina glukozê de tune, ku cûdahiya girîng di navbera hucreyên T yên di vitro de hatine çandin û TIL-a mirovî ya di vivo de destnîşan dike (22). Ev çavdêrî bi karanîna dabeşkirina nifûsa hucreyê ya otomatîk a bêalî jî hatin piştrast kirin, ku bêtir eşkere kir ku hucreyên CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ bi kişandina glukozê û çalakiya mîtokondrî ji hucreyên tumorê bilindtir belav in lê nifûsa hucreyên çalak ên metabolîk hene. Ev nifûs dikare binpopulasyona texmînkirî ya hucreyên tepeserker ên mîyeloîd an hucreyên dendrîtîk ên plazmasîtoîd ên ku di analîza scRNA-seq de hatine nas kirin temsîl bike. Her çend her du jî di tumorên hêkdankên mirovan de hatine ragihandin [45], ew hîn jî hewceyê xebata din in ji bo danasîna vê jêrpopulasyona mîyeloîd.
Her çend rêbazên li ser bingeha sîtometriya herikînê dikarin cûdahiyên giştî yên di metabolîzma glukozê û oksîdatîf de di navbera celebên hucreyan de zelal bikin jî, metabolîtên rastîn ên ku ji hêla glukozê an çavkaniyên din ên karbonê ve ji bo metabolîzma mîtokondrî di TME de têne hilberandin hîn nehatine destnîşankirin. Destnîşankirina hebûn an nebûna metabolîtan ji bo komek TIL ya diyarkirî pêdivî bi paqijkirina nifûsa hucreyê ji tevna jêkirî heye. Ji ber vê yekê, rêbaza me ya dewlemendkirina hucreyê bi spektrometriya girseyî re dikare têgihîştinê li ser metabolîtên ku di hucreyên T û nifûsa hucreyên tumorê de di nimûneyên nexweşên hevber de bi awayekî cûda dewlemend dibin peyda bike. Her çend ev rêbaz li ser rêzkirina hucreyên bi fluoresansê çalakkirî avantajên xwe hene jî, dibe ku hin pirtûkxaneyên metabolîtan ji ber aramiya xwerû û/an rêjeya zivirîna bilez bandor bibin (22). Digel vê yekê, rêbaza me karibû du metabolîtên îmmunosupresîf ên naskirî, adenosine û kynurenine, nas bike, ji ber ku ew di navbera celebên nimûneyan de pir diguherin.
Analîza me ya metabonomîk a tumor û jêr-cureyên TIL têgihîştinên bêtir li ser rola metabolîtan di TME ya hêkdankê de peyda dike. Pêşî, bi karanîna sîtometriya herikînê, me diyar kir ku di navbera tumor û hucreyên CD4 + T de di çalakiya mîtokondrî de cûdahî tune. Lêbelê, analîza LC-MS/MS guhertinên girîng di pirbûna metabolîtan de di nav van nifûsan de eşkere kir, ku nîşan dide ku encamên li ser metabolîzma TIL û çalakiya wê ya metabolîk a giştî şîrovekirinek baldar hewce dike. Ya duyemîn, MNA metabolîta ku cûdahiya herî mezin di navbera hucreyên CD45 û hucreyên T de di asîtan de heye, ne di tumoran de. Ji ber vê yekê, dabeşkirin û cîhê tumorê dibe ku bandorên cûda li ser metabolîzma TIL hebin, ku nehevsengiya gengaz di mîkrojîngehek diyarkirî de ronî dike. Ya sêyemîn, îfadeya enzîma hilberînerê MNA NNMT bi giranî bi CAF ve sînorkirî ye, ku di astek kêmtir de hucreyên tumorê ne, lê astên MNA yên tespîtkirî di hucreyên T yên ji tumorê hatine wergirtin de têne dîtin. Zêdebûna îfadeya NNMT di CAF ya hêkdankê de bandorek pêşvebirina penceşêrê ya naskirî heye, qismî ji ber pêşvebirina metabolîzma CAF, dagirkirina tumor û metastazê (27). Her çend asta giştî ya TIL nerm be jî, îfadeya NNMT di CAF de bi subtype mezenchymal Atlas Genome Cancer (TCGA) ve girêdayî ye, ku bi prognozek xirab ve girêdayî ye (27, 46, 47). Di dawiyê de, îfadeya enzîma AOX1 a berpirsiyarê hilweşandina MNA jî bi nifûsa CAF ve sînorkirî ye, ku nîşan dide ku hucreyên T ne xwedî şiyana metabolîzekirina MNA ne. Ev encam piştgirî didin wê ramanê ku her çend ji bo verastkirina vê dîtinê xebatek din hewce be jî, asta bilind a MNA di hucreyên T de dibe ku hebûna mîkrojîngehek CAF ya îmmunosupresîf nîşan bide.
Ji ber asta nizm a îfadeya veguhezkarên MNA û astên neteqandî yên proteînên sereke yên ku di metabolîzma MNA de beşdar in, hebûna MNA di hucreyên T de neçaverêkirî ye. Ne NNMT û ne jî AOX1 bi analîza scRNA-seq û qPCR-ya hedefgirtî ya du kohortên serbixwe nehatin tespît kirin. Ev encam nîşan didin ku MNA ji hêla hucreyên T ve nayê sentez kirin, lê ji TME-ya derdorê tê kişandin. Ceribandinên in vitro nîşan didin ku hucreyên T meyla komkirina MNA-ya derveyî dikin.
Lêkolînên me yên in vitro nîşan dane ku MNA ya eksojen îfadeya TNFα di hucreyên T de çalak dike û girêdana Sp1 bi pêşvebirê TNFα re zêde dike. Her çend TNFα hem fonksiyonên dijî-tûmor û hem jî dijî-tûmor hebin jî, di kansera hêkdankê de, TNFα dikare mezinbûna kansera hêkdankê pêşve bibe (31-33). Bêbandorkirina TNFα di çanda hucreya tumora hêkdankê de an jî jiholêrakirina sînyala TNFα di modelên mişk de dikare hilberîna sîtokîna înflamatuar a bi navbeynkariya TNFα baştir bike û mezinbûna tumorê asteng bike (32, 35). Ji ber vê yekê, di vê rewşê de, MNA ya ji TME hatî wergirtin dikare wekî metabolîtek pro-înflamatuar bi rêya mekanîzmayek girêdayî TNFα bi rêya lûpa otokrîn tevbigere, bi vî rengî çêbûn û belavbûna kansera hêkdankê pêşve bibe (31). Li ser bingeha vê îhtîmalê, astengkirina TNFα wekî ajanek dermankirinê ya potansiyel ji bo kansera hêkdankê tê lêkolîn kirin (37, 48, 49). Wekî din, MNA sîtotoksîsîteya hucreyên CAR-T ji bo hucreyên tumora hêkdankê xirab dike, ku delîlên din ji bo tepeserkirina parastinê ya bi navbeynkariya MNA peyda dike. Bi hev re, ev encam modelek pêşniyar dikin ku tê de tumor û hucreyên CAF MNA vedişêrin nav TMEya derveyî hucreyê. Bi rêya (i) teşwîqkirina mezinbûna kansera hêkdankê ya ji hêla TNF ve hatî çalak kirin û (ii) astengkirina çalakiya sîtotoksîk a hucreya T ya ji hêla MNA ve hatî çalak kirin, ev dibe ku bandorek dualî ya tumor hebe (Wêne 5D).
Di encamê de, bi sepandina tevlîheviyek ji dewlemendkirina bilez a hucreyan, rêzkirina hucreyên yekane û profîlkirina metabolîk, vê lêkolînê cûdahiyên mezin ên îmmunometabolomîk di navbera hucreyên tumor û asîtê de di nexweşên HGSC de eşkere kir. Vê analîza berfireh nîşan da ku di navbera hucreyên T de cûdahî di wergirtina glukozê û çalakiya mîtokondrî de hene, û MNA wekî metabolîtek rêkûpêk a îmmun a xweser a ne-hucreyî destnîşan kir. Van daneyan bandor li ser ka TME çawa bandorê li metabolîzma hucreya T di penceşêrên mirovan de dike dikin. Her çend pêşbaziya rasterast ji bo xurdemeniyan di navbera hucreyên T û hucreyên penceşêrê de hatiye ragihandin jî, metabolîtan dikarin wekî rêkûpêkên nerasterast jî tevbigerin da ku pêşveçûna tumorê pêşve bibin û dibe ku bersivên îmmun ên endojîn tepeser bikin. Danasîna bêtir a rola fonksiyonel a van metabolîtên rêkûpêk dibe ku stratejiyên alternatîf ji bo zêdekirina bersiva îmmun a dij-tumor veke.
Nimûneyên nexweşan û daneyên klînîkî bi rêya depoya şaneyên tumora penceşêrê ya BC-ê ku ji hêla Tora Depoya Şaneyan a Kanadayî ve hatî pejirandin, hatin bidestxistin. Li gorî protokola ku ji hêla Komîteya Etîka Lêkolîna Penceşêrê ya BC û Zanîngeha British Columbia (H07-00463) ve hatî pejirandin, hemî nimûne û daneyên klînîkî yên nexweşan razîbûna nivîskî ya agahdarkirî an jî bi fermî razîbûna xwe berdane wergirtine. Nimûne di BioBank-a pejirandî (BRC-00290) de têne hilanîn. Taybetmendiyên nexweş ên berfireh di Tabloyên S1 û S5 de têne nîşandan. Ji bo krîoprezervasyonê, skalpelek tê bikar anîn da ku nimûneya tumora nexweş bi awayekî mekanîkî were hilweşandin û dûv re bi fîlterek 100 mîkron re were derbas kirin da ku suspensiyonek şaneyek yekane were bidestxistin. Asîta nexweş ji bo 10 hûrdeman li 4°C bi 1500 rpm hate santrifuj kirin da ku şaneyan pelet bikin û supernatant were rakirin. Hucreyên ji tumor û asîtan hatine bidestxistin di nav %50 seruma AB ya mirovî ya bi germê neçalakkirî (Sigma-Aldrich), %40 RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) û %10 dimetil sulfoksîd de hatin krîyoparastin. Ev rawestandinên hucreyên yekane yên parastî hatin helandin û ji bo metabolomîk û diyarkirina metabolîtan a ku li jêr hatî vegotin hatin bikar anîn.
Medyaya tevahî ji 0.22 μm fîltrekirî 50:50 RPMI 1640 pêk tê: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) ku bi 10% seruma AB ya mirovî ya bi germê neçalakkirî (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x çareseriya Penîsîlîn Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) û 50 μMB-merkaptoetanol hatiye zêdekirin. AimV (Invitrogen) bi 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) û 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) hatiye zêdekirin. Tampona boyaxkirina sîtometreya herikînê ji 0.22 μm şorbeya tamponkirî ya fosfatê ya fîltrekirî (PBS; Invitrogen) pêk tê ku bi 3% seruma AB ya mirovî ya bi germê neçalakkirî (Sigma) hatiye zêdekirin. Tampona dewlemendkirina şaneyan ji PBS-ya fîltrekirî ya 0.22μm pêk tê û bi seruma AB ya mirovî ya bi germê neçalakkirî ya %0.5 (Sigma-Aldrich) hatiye temamkirin.
Di navgîna temam a 37°C de, şane bi 10 nM MT DR û 100 μM 2-NBDG bo 30 deqîqeyan hatin boyaxkirin. Piştre, şane bi boyaxa jiyanbariyê eF506 di 4°C de bo 15 deqîqeyan hatin boyaxkirin. Şaneyan di FC Block (eBioscience) û Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) de ji nû ve bihelînin, di tampona boyaxkirina sîtometreya herikînê de (li gorî rêwerzên çêker) de bihelînin, û di germahiya odeyê de bo 10 deqîqeyan înkubasyon bikin. Şaneyan bi komek antîkoran (Tabloya S2) di tampona boyaxkirina sîtometreya herikînê de bo 4°C bo 20 deqîqeyan boyax bikin. Berî analîzê, şaneyan di tampona boyaxkirina sîtometreya herikînê (Cytek Aurora; mîhenga 3L-16V-14B-8R) de ji nû ve bihelînin. Ji bo analîzkirina daneyên jimara şaneyan SpectroFlo û FlowJo V10 bikar bînin, û ji bo çêkirina daneyan GraphPad Prism 8 bikar bînin. Şîddeta navîn a fluoresansê (MFI) ya 2-NBDG û MT DR bi log-normalîzekirinê hate kirin, û dûv re testa t ya cotkirî ji bo analîza îstatîstîkî hate bikar anîn da ku nexweşên hevberkirî hesab bike. Hemî nifûsên ku ji 40 bûyeran kêmtir in ji analîzê derxînin; berî ku analîza îstatîstîkî û dîtbarîkirina daneyan pêk bînin, ji bo her nirxên neyînî nirxek MFI ya 1 binivîsin.
Ji bo temamkirina stratejiya derîkirina destî ya panela pêvajoya jorîn, me şîrovekirina tevahî ya ji hêla dara sînordarkirina şeklê (FAUST) (21) ve bikar anî da ku piştî rakirina şaneyên mirî di FlowJo de, şaneyan bixweber li nifûsê bidin destnîşankirin. Em bi destan deranê birêve dibin da ku nifûsên ku xuya dikin xelet hatine dabeş kirin (têkelkirina şaneyên tumorê PD1+ bi PD1-ê re) û nifûsên parastî bikin yek. Her nimûne bi navînî ji %2 zêdetir şaneyan dihewîne, ji bo tevahî 11 nifûsan.
Santrifujkirina densiteya gradyanta Ficoll ji bo veqetandina PBMC ji berhemên veqetandina leukosîtan (STEMCELL Technologies) hate bikar anîn. Hucreyên CD8 + T ji PBMC bi karanîna CD8 MicroBeads (Miltenyi) hatin veqetandin û li gorî rêwerzên çêker 2 hefteyan bi karanîna TransAct (Miltenyi) di navgîna tevahî de hatin berfireh kirin. Hucre hatin hiştin ku 5 rojan di navgîna tevahî de ku IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) tê de heye bisekinin, û dûv re bi TransAct ji nû ve hatin teşwîq kirin. Di roja 7-an de, li gorî rêwerzên çêker, CD45 MicroBeads-ên mirovî (Miltenyi) ji bo dewlemendkirina hucreyan di sê dorên li pey hev de hatin bikar anîn. Hucre ji bo analîza sîtometriya herikînê (wekî ku li jor hatî vegotin) hatin alîkot kirin, û yek mîlyon hucre sê caran ji bo analîza LC-MS/MS hatin alîkot kirin. Nimûne bi LC-MS/MS wekî ku li jêr hatî vegotin hatin pêvajo kirin. Me nirxa metabolîta winda bi hejmarek îyonê 1,000 texmîn kir. Her nimûne berî analîzê bi jimara giştî ya îyonê (TIC) tê normalîzekirin, bi logarîtmîkî tê veguherandin û di MetaboAnalystR de bixweber tê normalîzekirin.
Suspensiyona şaneya yekane ya her nexweşek hate helandin û bi fîlterek 40 μm ve hate fîltrekirin nav navgîniya tevahî (wekî ku li jor hatî vegotin). Li gorî protokola çêker, sê dorên hilbijartina erênî yên li pey hev bi veqetandina mûyên magnetîkî bi karanîna MicroBeads (Miltenyi) hatin bikar anîn da ku nimûneyan ji bo şaneyên CD8+, CD4+ û CD45- (li ser qeşayê) dewlemend bikin. Bi kurtasî, şaneyan di tampona dewlemendkirina şaneyan de (wekî ku li jor hatî vegotin) ji nû ve têne daliqandin û têne jimartin. Şane bi mûyên CD8 yên mirovî, mûyên CD4 yên mirovî an mûyên CD45 yên mirovî (Miltenyi) re di 4°C de ji bo 15 hûrdeman hatin înkubasyon kirin, û dûv re bi tampona dewlemendkirina şaneyan hatin şuştin. Nimûne di stûna LS (Miltenyi) re tê derbas kirin, û fraksiyonên erênî û neyînî têne berhev kirin. Ji bo kêmkirina dem û zêdekirina gava vegerandina şaneyan, dûv re fraksiyona CD8 ji bo dora duyemîn a dewlemendkirina CD4+ tê bikar anîn, û fraksiyona CD4 ji bo dewlemendkirina CD45 ya paşîn tê bikar anîn. Çareseriyê di tevahiya pêvajoya veqetandinê de li ser qeşayê bihêlin.
Ji bo amadekirina nimûneyan ji bo analîza metabolîtan, şane carekê bi çareseriya xwê ya sar a bi qeşayê hatin şuştin, û 1 ml metanola %80 li her nimûneyê hat zêdekirin, dû re hatin vortexkirin û di nîtrojena şil de hatin cemidandin. Nimûne sê çerxên cemidandin-helandinê derbas kirin û di 14,000 rpm de ji bo 15 hûrdeman di 4°C de hatin santrifujkirin. Serpernatantê ku metabolîtan tê de hene heta ku hişk bibin buhar bû. Metabolîtan di 50 μl asîda formîk a %0.03 de ji nû ve hatin çareserkirin, ji bo tevlihevkirinê hatin vortexkirin, û dû re ji bo rakirina bermayiyan hatin santrifujkirin.
Metabolîtan wekî ku li jor hatî vegotin derxînin. Ji bo lêkolîna metabolomîkê, serperiştê veguhezînin şûşeyek kromatografiya şilek a performansa bilind. Ji bo pêşîgirtina li bandorên komê, protokolek dermankirina rasthatî bikar bînin da ku her nimûne bi hejmarek wekhev a şaneyan derman bikin. Me nirxandinek kalîtîf a metabolîtên gerdûnî pêk anî ku berê li ser AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) hatibû weşandin. Analîza kromatografîk û entegrasyona qada lûtkeyê bi karanîna nermalava MultiQuant guhertoya 2.1 (Applied Biosystems SCIEX) hate kirin.
Ji bo texmînkirina nirxa metabolîta wenda, jimara îyonê ya 1000 hate bikar anîn, û TIC ya her nimûneyê ji bo hesabkirina qada lûtkeya normalîzekirî ya her metabolîta tespîtkirî hate bikar anîn da ku guhertinên ku ji hêla analîza amûrî ve ji pêvajoya nimûneyê hatine çêkirin rast bike. Piştî ku TIC normalîze bû, MetaboAnalystR(51) (parametreya xwerû) ji bo veguherîna logarîtmîk û pîvandina xeta normê ya otomatîk tê bikar anîn. Me PCA bi pakêta vegan R bikar anî da ku analîza lêgerînê ya cûdahiyên metabolomê di navbera celebên nimûneyan de pêk bîne, û analîza dubarebûna qismî bikar anî da ku nexweşan analîz bike. Rêbaza Ward bikar bînin da ku dendrogramek nexşeya germê ava bikin da ku dûrahiya Euclidean di navbera nimûneyan de kom bikin. Me limma (52) li ser pirbûna metabolîta standardîzekirî bikar anî da ku metabolîtên bi pirbûna cûda li seranserê tevahiya celebê hucreyê û mîkrojîngehê nas bikin. Ji bo hêsankirina ravekirinê, em parametreya navînî ya komê bikar tînin da ku modelê diyar bikin, û celebên hucreyan di mîkrojîngehê de wekî her komê (n = 6 kom) bihesibînin; Ji bo testa girîngiyê, me ji bo her metabolîtê sê pîvandinên dubare pêk anîn. Ji bo ku em ji dubarebûna derewîn dûr bikevin, nexweş wekî astengiyek di sêwirana lîmmayê de hate zêdekirin. Ji bo ku em cûdahiyên di metabolîtan de di navbera nexweşên cûda de kontrol bikin, me modela lîmmayê bi awayekî sabît verast kir û nexweşan jî di nav de bi cih kir. Em girîngiya berevajîya pêşwext diyarkirî di navbera celebê şaneyê û mîkrojîngeha Padj <0.05 (sererastkirina Benjamini-Hochberg) de radigihînin.
Piştî dewlemendkirina bi hêz bi karanîna Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% zindîbûn), rêzkirina transkrîptoma yek-hucreyî li ser tevahiya asîtên zindî yên cemidî û nimûneyên tumor bi karanîna protokola îfadeya gena 10x 5′ hate kirin. Pênc dozên bi tumor û asîtên hevber hatin analîzkirin, her çend zindîbûna kêm ji yek nimûneya tumorê rê li ber têxistina wê girt. Ji bo ku em gelek hilbijartin ji nexweşan bi dest bixin, me nimûneyên her nexweşek di rêzikên kontrolkera kromê 10x de li hev kirin, û asît û cihên tumorê ji hev cuda analîz kirin. Piştî rêzkirina [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp dawiya cotkirî (PE), genoma Quebec; bi navînî 73,488 û 41,378 xwendin li ser her şaneyekê ji bo tumor û asîtê]], me CellSNP û Vireo (53) bikar anîn (li ser bingeha CellSNP wekî SNP-ya mirovî ya hevpar (VCF) ku ji hêla GRCh38 ve hatî peyda kirin nasnameyek donor lê tê destnîşankirin. Em SNPRelate bikar tînin da ku nasnameya herî nêzîk (IBS) ya rewşa genotîpa nexweş (IBS) derxînin, şaneyên nedestnîşankirî û şaneyên ku wekî dupleks hatine destnîşankirin û donorên hevber di navbera nimûneyên asîtê û tumorê de ji bilî (54). Li ser bingeha vê peywirê, me sê doz bi temsîliyeta şaneyên pir di tumor û asîtê de ji bo analîza paşîn girtin. Piştî ku gavek fîltrekirina girseyî di pakêta BioConductor a belavker (55) û scranê (56) de pêk anî, ev ji bo analîzê 6975 şaneyan (bi rêzê ve 2792 û 4183 şaneyên ji tumor û asîtê) derxist. Em komkirina Louvain a tora cîranê herî nêzîk a hevpar (SNN) ya igraph (57) li ser bingeha dûrbûna Jaccard ji şaneyên komê bi îfadeyê bikar tînin. Kom bi destan li gorî îfadeya gena nîşanker li gorî celebên şaneyên gumanbar hatin şîrovekirin û bi t-SNE hatin xuyangkirin. Hucreyên T yên sîtotoksîk bi îfadeya CD8A û GZMA têne pênasekirin, ji bilî binkomên bi îfadeya proteîna rîbozomal a kêm. Me daneyên weşandî yên Izar et al. (16) bi dest xistin, tevî bicihkirina wan a t-SNE, dikarin hevgirtina îfadeyê di navbera nîşankerên şaneyên parastinê û îfadeya NNMT de kontrol bikin.
PBMC bi santrifujkirina densiteya gradyanta Ficoll ji berhemên veqetandina leukosîtan (STEMCELL Technologies) hatin veqetandin. Hucreyên CD3+ bi karanîna mûyên CD3 (Miltenyi) ji PBMC hatin veqetandin. Di hebûn an nebûna MNA de, hucreyên CD3+ bi CD3-ya girêdayî plakeyê (5μg/ml), CD28-ya çareserker (3μg/ml) û IL-2 (300 U/ml; Proleukin) hatin çalak kirin. Di roja dawî ya berfirehbûnê de, jiyanbarî (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) û zêdebûn (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) bi sîtometrîya herikînê hatin nirxandin. Fonksiyona bandorker bi teşwîqkirina şaneyan bi PMA (20 ng/ml) û îyonomîsîn (1μg/ml) bi GolgiStop bo 4 saetan binirxînin, û CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) û TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) bişopînin. Şaneyên qPCR û ChIP bi PMA (20 ng/ml) û îyonomîsîn (1μg/ml) bo 4 saetan teşwîq bikin. Supernatant ELISA berî û piştî teşwîqkirinê bi PMA (20 ng/ml) û îyonomîsîn (1 μg/ml) bo 4 saetan hate berhevkirin.
Ji bo veqetandina RNA-yê bi karanîna RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) protokola çêker bişopînin. Ji bo homojenîzekirina nimûneyê QIAshredder (QIAGEN) bikar bînin. Ji bo sentezkirina DNA-ya temamker (cDNA) kîta RNA-ya kapasîteya bilind ji bo cDNA (Thermo Fisher Scientific) bikar bînin. Ji bo pîvandina îfadeya genê (li gorî protokola çêker) bi probên jêrîn TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) bikar bînin: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glîseraldehîd-3-fosfat ji Hîdrojenê (GAPDH)] û Hs01010726_m1 (SLC22A2). Nimûne li ser sîstema PCR ya demrast a StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) di plakaya reaksiyonê ya optîkî ya bilez a 96-qulî ya MicroAmp (Applied Biosystems) de bi fîlima optîkî ya MicroAmp hatin xebitandin. Her nirxa Ct ku ji 35 derbas dibe wekî li jorê eşika tespîtkirinê tê hesibandin û wekî nayê tespîtkirin tê nîşankirin.
ChIP wekî ku berê hatiye vegotin (58) pêk bînin. Bi kurtasî, şane bi formaldehîdê (konsantrasyona dawî 1.42%) hatin dermankirin û 10 deqîqeyan di germahiya odeyê de hatin înkubasyonkirin. Tampona werimandinê ya zêdekirî (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl û 0.1% NP-40) li ser qeşayê 10 deqîqeyan bikar bînin, dûv re di tampona îmmunoprecipitasyonê de wekî ku hatiye vegotin (58) ji nû ve sûnîze bikin. Piştre nimûne bi çerxên jêrîn hate sonîkkirin: 10 çerx (20 pulsên 1-çirkeyî) û demek statîk a 40 saniyeyan. Antîkorên îmmunoglobulin G ya pola ChIP (Teknolojiya Sînyala Hucreyê; 1μl), hîston H3 (Teknolojiya Sînyala Hucreyê; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) û SP1 (Teknolojiya Sînyala Hucreyê; 3μl) bi nimûneyê re di 4°CC de înkubasyon bikin û tevahiya şevê bihejînin. Morîkên proteîna A (Thermo Fisher Scientific) bi nimûneyê re li germahiya 4°C bi hejandina sivik bo saetekê înkubasyon bikin, paşê ji bo dewlemendkirina DNAyê moîkên chelex (Bio-Rad) bikar bînin, û ji bo helandina proteînê proteînaz K (Thermo Fisher) bikar bînin. Promotera TNFα bi PCRê hat tespîtkirin: pêşve, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; berevajî vê, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (berhema 207-bp). Wêne ji hêla Image Lab (Bio-Rad) ve hatin hilberandin û bi karanîna nermalava ImageJ hatin pîvandin.
Serpernatantê çanda şaneyê wekî ku li jor hatî vegotin hate berhevkirin. Tesbîtkirin li gorî prosedurên çêker ên kîta ELISA ya TNFα ya mirovî (Invitrogen), kîta ELISA ya IL-2 ya mirovî (Invitrogen) û kîta ELISA ya IFN-γ ya mirovî (Abcam) hate kirin. Li gorî protokola çêker, serpernatant ji bo tespîtkirina TNFα û IL-2 1:100, û ji bo tespîtkirina IFN-γ 1:3 hate şilkirin. Ji bo pîvandina vegirtinê li 450 nm, EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) bikar bînin.
PBMC bi santrifujkirina densiteya gradyanta Ficoll ji berhemên veqetandina leukosîtan (STEMCELL Technologies) hatin veqetandin. Hucreyên CD3+ bi karanîna mûyên CD3 (Miltenyi) ji PBMC hatin veqetandin. Di hebûn an nebûna MNA de, hucreyên CD3+ bi CD3-ya girêdayî plakeyê (5μg/ml), CD28-ya çareserker (3μg/ml) û IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ji bo 3 rojan hatin çalakirin. Piştî 3 rojan, hucre hatin berhevkirin û bi 0.9% şor hatin şuştin, û pelet bi lez hate cemidandin. Jimartina hucreyan bi sîtometrîya herikînê (Cytek Aurora; mîhenga 3L-16V-14B-8R) bi karanîna 123count eBeads hate kirin.
Metabolîtan wekî ku li jor hatî vegotin derxînin. Ekstrakta hişkkirî bi rêjeya 4000 ekîvalentên şaneyê/μl ji nû ve hate çêkirin. Nimûneyê bi kromatografiya qonaxa berevajî (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) û stûna CORTECS T3 (2.1×150 mm, mezinahiya perçeyan 1.6-μm, mezinahiya poran 120-Å; #186008500, Waters) analîz bikin. Spektrometreya girseya polar (6470, Agilent), ku tê de îyonîzasyona elektrospray di moda erênî de dixebite. Qonaxa mobîl A %0.1 asîda formîk e (di H2O de), qonaxa mobîl B %90 asetonitrîl, %0.1 asîda formîk e. Gradienta LC ji bo 100% A 0 heta 2 xulek, ji bo 99% B 2 heta 7.1 xulek, û ji bo 99% B 7.1 heta 8 xulek e. Dû re stûn bi rêjeya herikîna 0.6 ml/min ji bo 3 xulekan ji nû ve hevseng bike. . Rêjeya herikînê 0.4 ml/min e, û odeya stûnê heta 50°C tê germ kirin. Ji bo destnîşankirina dema ragirtinê (RT) û veguherînê (RT = 0.882 xulek, veguherîn 1 = 137→94.1, veguherîn 2 = 137→92, Veguherîn 3 = 137→78), standarda kîmyewî ya saf a MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) bikar bîne. Dema ku her sê veguheztin di dema ragirtinê ya rast de çêdibin, veguheztina 1 ji bo pîvandinê tê bikar anîn da ku taybetmendiyê misoger bike. Xêza standard a MNA (Toronto Research Chemical Company) bi şeş dilopkirinên rêzefîlmî yên çareseriya stok (1 mg/ml) hate çêkirin da ku standardên 0.1, 1.0, 10 û 100 ng/ml û 1.0 û 10μg/ml şilek bi dest bixin. Sînorê tespîtkirinê 1 ng/ml e, û bersiva xêzik di navbera 10 ng/ml û 10μg/ml de ye. Her derzîkirina du mîkrolître nimûne û standard ji bo analîza LC/MS tê bikar anîn, û her heşt derzîkirinên nimûneyek kontrolkirina kalîteyê ya tevlihev tê meşandin da ku aramiya platforma analîzê were misoger kirin. Bersivên MNA yên hemî nimûneyên hucreyê yên bi MNA hatine dermankirin di nav rêza xêzik a ceribandinê de bûn. Analîza daneyan bi karanîna nermalava analîza hejmarî ya MassHunter (v9.0, Agilent) hate kirin.
Avakirina αFR-CAR a nifşê duyem ji Song et al. (59) hatiye girtin. Bi kurtasî, avahî van naverokan dihewîne: rêza rêberê CD8a, perçeya guhêrbar a zincîra yekane ya taybetî ya αFR ya mirovî, herêma menteşe û transmembranê ya CD8a, domaina navxaneyî ya CD27 û domaina navxaneyî ya CD3z. Rêza CAR a temam ji hêla GenScript ve hatiye sentezkirin, û dûv re di vektora îfadeya lentiviral a nifşê duyem de li jorê kaseta îfadeya GFP-ê ya ku ji bo nirxandina karîgeriya veguhastinê tê bikar anîn, hatiye klonkirin.
Lentivirus bi transfektasyona şaneyên HEK293T [Koleksiyona Çanda Tîpa Amerîkî (ATCC)] tê hilberandin; di navgîna Eagle ya guhertî ya Dulbecco de ku 10% seruma fetal a ga (FBS) û 1% PenStrep tê de heye, tê çandin û vektora CAR-GFP tê bikar anîn û plazmîdên pakkirinê (psPAX2 û pMD2.G, Addgene) amîneya lipofektasyonê (Sigma-Aldrich) bikar tînin. Supernatantê ku vîrus tê de heye 48 û 72 demjimêran piştî transfektasyonê hate berhevkirin, hate fîltrekirin û bi ultrasantrifûjkirinê hate konsantrekirin. Supernatantê vîrusî yê konsantrekirî heta transduksiyonê li -80°C hilînin.
PBMC ji berhemên veqetandina leukosît ên donorên saxlem (STEMCELL Technologies) bi santrifujkirina densiteya gradient a Ficoll têne veqetandin. Mîkrobeadên CD8 yên hilbijartina erênî (Miltenyi) bikar bînin da ku hucreyên CD8+ ji PBMC veqetînin. Hucreyên T bi TransAct (Miltenyi) û di navgîna TexMACS de [Miltenyi; bi 3% seruma mirovî ya bêbandorkirî ya germê, 1% PenStrep û IL-2 (300 U/ml) ve hatî zêdekirin teşwîq bikin. Bîst û çar demjimêran piştî teşwîqkirinê, hucreyên T bi lentivirus (10 μl supernatantê vîrusê yê konsantre ji bo her 106 hucreyan) hatin transduksiyon kirin. 1 heta 3 roj piştî transduksiyon li ser Cytek Aurora (li ser FSC (Belavbûna Pêş)/SSC (Belavbûna Alî), Singlet, GFP+), îfadeya GFP ya hucreyan binirxînin da ku karîgeriya transduksiyonê ya herî kêm 30% nîşan bidin.
Hucreyên CAR-T di Immunocult (STEMCELL Technologies; bi 1% PenStrep hatiye zêdekirin) de di bin şert û mercên jêrîn de ji bo 24 saetan hatin çandin: bê dermankirin, bi 250 μM adenozîn an 10 mM MNA hatine dermankirin. Piştî pêşdermankirinê, hucreyên CAR-T bi PBS hatin şuştin û bi 20,000 hucreyên SK-OV-3 [ATCC; di navgîna McCoy 5A (Sigma-Aldrich) de ku bi 10% FBS û 1% PenStrep hatiye zêdekirin di 10 de hatin tevlihevkirin: Rêjeya bandorker berbi hedefê ya 1 sê caran di navgîna Immunocult a zêdekirî de hate zêdekirin. Hucreyên SK-OV-3 û hucreyên SK-OV-3 yên ku bi saponin a dîjîtal (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) hatine lîzkirin, bi rêzê ve, wekî kontrolên neyînî û erênî hatin bikar anîn. Piştî 24 demjimêran çandina hevbeş, serzêde hat berhevkirin û laktat dehydrogenaz (LDH) li gorî rêwerzên çêker (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) hat pîvandin. Serzêdede LDH di tampona LDH de 1:50 hat şilkirin. Rêjeya kuştinê bi karanîna formula jêrîn hat pîvandin: rêjeya kuştinê = rêjeya rastkirinê / rêjeya kuştina herî zêde x 100%, ku rêjeya rastkirinê = çandina hevbeş-tenê hucreyên T, û rêjeya kuştina herî zêde = kontrola erênî-kontrola neyînî.
Wekî ku di nivîsê de an jî di materyal û rêbazan de hatiye vegotin, ji bo analîza îstatîstîkî GraphPad Prism 8, Microsoft Excel an R v3.6.0 bikar bînin. Ger ji heman nexweş gelek nimûne werin berhevkirin (wek asît û tumor), em testa t-ya cotkirî bikar tînin an jî nexweş wekî bandorek rasthatî di modelek xêzikî an giştî de li gorî guncan vedihewînin. Ji bo analîza metabolomîkî, testa girîngiyê sê caran tê kirin.
Ji bo materyalên pêvek ên vê gotarê, ji kerema xwe li http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 binêrin.
Ev gotareke gihîştina vekirî ye ku li gorî şertên Lîsansa Creative Commons Attribution-Non-Commercial tê belavkirin, ku destûrê dide karanîn, belavkirin û hilberandinê di her medyayê de, heya ku karanîna dawîn ne ji bo berjewendiya bazirganî be û pêşgotin ew be ku xebata orîjînal rast be. Çavkanî.
Têbînî: Em tenê ji we dixwazin ku hûn navnîşana e-nameya xwe bidin da ku kesê ku hûn pêşniyarî rûpelê dikin bizanibe ku hûn dixwazin ew e-nameyê bibînin û ew ne spam e. Em ê tu navnîşanên e-nameyan negirin.
Ev pirs ji bo ceribandina ka hûn mêvan in û pêşîgirtina şandina otomatîkî ya spamê tê bikar anîn.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson (Brad H. Nelson) DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA beşdarî tepeserkirina sîstema parastinê ya hucreyên T dibe û hedefeke potansiyel a îmûnoterapiyê ji bo dermankirina penceşêra mirovan temsîl dike.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson (Brad H. Nelson) DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA beşdarî tepeserkirina sîstema parastinê ya hucreyên T dibe û hedefeke potansiyel a îmûnoterapiyê ji bo dermankirina penceşêra mirovan temsîl dike.
©2021 Komeleya Amerîkî ji bo Pêşveçûna Zanistê. hemû maf parastî ne. AAAS hevparê HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef û COUNTER e. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.